氣道高反應(yīng)性發(fā)生條件及機制的探討.pdf

1、氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性是哮喘的基本特征。哮喘患者是否上氣道在沒有直接接觸變應(yīng)原的情況下出現(xiàn)氣道炎癥和反應(yīng)性增高？這對于研究氣道高反應(yīng)性的發(fā)生條件和機制有很好的啟發(fā)作用，也具有很重要的臨床意義。 研究目的： 應(yīng)用不同大小的變應(yīng)原顆粒霧化小鼠，嘗試建立具有明顯的EOS氣道炎癥、但無氣道高反應(yīng)性的BALB/c小鼠模型，并將該模型與哮喘模型進行病理學及蛋白組學的比較，以篩選鑒定與氣道高反應(yīng)性、氣流可逆性阻塞相關(guān)的蛋白，為進一步研

2、究氣道炎癥及氣道高反應(yīng)性的發(fā)生機制奠定基礎(chǔ)；對小鼠氣道不同部位進行變應(yīng)原激發(fā)，探討遠端氣道在無變應(yīng)原直接刺激的情況下的氣道炎癥和反應(yīng)性。 研究內(nèi)容： 第一部分不同直徑變應(yīng)原對小鼠氣道高反應(yīng)性的影響及蛋白組學的比較 分題1應(yīng)用大顆粒變應(yīng)原霧化建立無氣道高反應(yīng)性的嗜酸粒細胞性氣道炎癥小鼠模型及與哮喘模型氣道炎癥的比較 方法：BALB/c雌性小鼠，分為3組，每組6～8只：大顆粒變應(yīng)原霧化激發(fā)組（下稱實驗組，霧化

3、顆粒的平均中位直徑8.6μm）、小顆粒變應(yīng)原霧化激發(fā)組（下稱哮喘組，霧化顆粒的平均中位直徑2.9μm）、生理鹽水對照組（下稱對照組）。致敏方法：第0、7、14天OVA（10μg）腹腔注射。實驗組第28、29、30天用PARI TIA噴霧器霧化I%OVA15min激發(fā)；哮喘組第28、29、30天用PARI LC STAR噴霧器霧化1%OVA15min激發(fā)；對照組致敏、激發(fā)采用生理鹽水。最后一次激發(fā)24、48、72、96h后應(yīng)用美國BUXC

4、O公司的有創(chuàng)氣道阻力與肺順應(yīng)性檢測系統(tǒng)（RC system）測定動物的氣道反應(yīng)性，并進行支氣管肺泡灌洗觀察氣道炎癥情況。在末次激發(fā)24和96h后，檢測小鼠的氣道炎癥程度，按照氣道周圍EOS浸潤的程度評0～4分，并觀察肺實質(zhì)的炎癥情況。 結(jié)果：1.氣道反應(yīng)性的測定：末次激發(fā)24、48、72、96h后，各組RL均有隨Mch濃度升高而增加的趨勢。哮喘組在各個濃度Mch的RL均高于實驗組和對照組，表明哮喘組的氣道反應(yīng)性高于實驗組和對照組

5、，實驗組與對照組的氣道反應(yīng)性差異在各個時間點均無統(tǒng)計學意義。 2.實驗組和哮喘組肺泡灌洗液中巨噬細胞百分率顯著低于對照組（P<0.05），而中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和淋巴細胞百分率顯著高于對照組（P<0.01）。 3.末次激發(fā)72、96h后，實驗組肺泡灌洗液中EOS比例逐步下降，表明具有明顯的嗜酸性粒細胞氣道炎癥、但無氣道高反應(yīng)性的BALB/c小鼠模型的氣道炎癥有逐步減輕的趨勢，但并未觀察到氣道反應(yīng)性的變化。 4

6、.末次激發(fā)24h后，哮喘組出現(xiàn)顯著的支氣管周圍EOS等炎癥細胞浸潤，肺泡管及肺泡內(nèi)可見EOS浸潤，而實驗組出現(xiàn)輕度的支氣管周圍EOS等炎癥細胞浸潤，肺泡管及肺泡內(nèi)無EOS浸潤炎癥，末次激發(fā)24h后哮喘組氣道炎癥病理評分（3.15±0.21）顯著高于實驗組（1.75±0.07，P<0.05），末次激發(fā)后96h后哮喘組氣道炎癥病理評分（2.65±0.11）仍然顯著高于實驗組（1.15±0.05，P<0.05）。 5.末次激發(fā)24～9

7、6h后，哮喘組肺泡管及肺泡內(nèi)均可見EOS浸潤，而實驗組肺泡管及肺泡內(nèi)均無EOS浸潤炎癥。 結(jié)論：通過應(yīng)用大顆粒變應(yīng)原進行霧化激發(fā)，本實驗初步成功建立了具有明顯的嗜酸性粒細胞氣道炎癥、但無氣道高反應(yīng)性的BALB/c小鼠模型，其氣道炎癥程度輕于哮喘模型組，氣道炎癥主要在大氣道周圍，接近EB的臨床病理特征。該模型為進一步研究氣道高反應(yīng)性的發(fā)生機制奠定了基礎(chǔ)。 分題2嗜酸粒細胞性支氣管炎小鼠模型與哮喘小鼠模型蛋白組學差異表達的初

8、步探討 方法：建立具有明顯的嗜酸性粒細胞氣道炎癥、但無氣道高反應(yīng)性的BALB/c小鼠模型、哮喘模型及對照小鼠各4只，激發(fā)后24h處死取肺組織提取總蛋白質(zhì)，利用固相pH梯度（immobilized pH gradient，IPG），雙向凝膠電泳（two-dimensional electrophoresis，2-DE）對總蛋白進行分離，然后行考馬斯亮藍染色，予ImageMaster2D Elite5.0分析軟件進行凝膠圖像分析，尋

9、找無氣道高反應(yīng)性的小鼠模型、哮喘模型和正常對照組差異表達的蛋白質(zhì)。應(yīng)用基質(zhì)輔助電離解析飛行時間質(zhì)譜（matrix-assitsted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）對蛋白質(zhì)進行序列分析，明確是何種蛋白質(zhì)。 結(jié)果：雙向電泳圖像對比分析表明，實驗組與哮喘組和正常對照組肺組織蛋白表達有一定的差異。經(jīng)質(zhì)譜檢測肽質(zhì)量指紋譜

10、與標準分子量、等電點對照分析鑒定出20個蛋白，分別為谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶M1（GSTMI）、熱休克蛋白B1等，其中熱休克蛋白B1在哮喘組表達上調(diào)、GSTM1表達下調(diào)。 結(jié)論：電泳圖像對比分析表明，實驗組與哮喘組之間肺組織蛋白表達存在一定的差異。成功鑒定了該模型和哮喘模型之間的差異表達蛋白，其中GSTM1、熱休克蛋白B1等可能參與氣道高反應(yīng)性的發(fā)生機制。 第二部分氣道不同部位激發(fā)對小鼠氣道高反應(yīng)性的影響 分題1小鼠

11、上氣道阻力及反應(yīng)性檢測方法的建立 方法：建立變應(yīng)性鼻炎小鼠模型，滴鼻激發(fā)后麻醉，分離氣管，胸廓開口處氣管切開插管，近喉部氣管切開插入18G插管進入鼻咽部，插管連接“T”形管，一端連接壓力傳感器，一端連接精密注射泵，應(yīng)用灌注／吸引模型模擬呼氣／吸氣，流量1mL/s，檢測鼻氣道的壓力差，計算出總阻力，并減去插管阻力得出鼻阻力，并對鼻腔進行組胺霧化激發(fā)，激發(fā)后3min檢測阻力變化。兩組的肺阻力也進行比較。氣道功能檢測后進行鼻灌洗收集鼻

12、灌洗液（NLF）及鼻病理組織學分析。 結(jié)果：鼻組織學顯示鼻黏膜有明顯的嗜酸性粒細胞浸潤，對照組的基礎(chǔ)鼻阻力為1.791±0.08 cm H2O ml-1 s-1，組胺激發(fā)后為3.037±0.48 cm H2O ml-1 s-1，鼻炎模型組的基礎(chǔ)鼻阻力為3.659±0.39 cm H2O ml-1 s-1，組胺激發(fā)后為7.643±1.41 cmH2O ml-1 s-1，兩組差異有統(tǒng)計學意義（P均<0.01）。對照組肺阻力為1.68

13、1±0.11 cmH2O ml-1 s-1。 結(jié)論：我們成功建立了小鼠體內(nèi)的鼻氣道阻力及反應(yīng)性檢測方法，鼻阻力約占全氣道阻力的50%以上，變應(yīng)性鼻炎小鼠模型阻力和反應(yīng)性明顯增高，鼻黏膜腫脹是鼻阻力增高的因素。 分題2單純上氣道變應(yīng)性炎癥對下氣道反應(yīng)性的影響 方法：BALB/c小鼠腹腔OVA（100μg）致敏并在清醒狀態(tài)下OVA（200μg）滴鼻激發(fā)，建立單純的上氣道變應(yīng)性炎癥模型，檢測鼻氣道的阻力和反應(yīng)性，同時檢

14、測下氣道阻力及反應(yīng)性，與對照組進行比較。兩組均進行鼻和肺病理組織學分析。 結(jié)果：清醒狀態(tài)下經(jīng)鼻滴伊文思藍溶液后發(fā)現(xiàn)絕大部分溶液分布在鼻腔，而在肺的分布與脾臟的分布無差異。單純上氣道炎癥組出現(xiàn)明顯的鼻阻力增加和反應(yīng)性增高，鼻組織學和NLF顯示鼻黏膜有明顯的嗜酸性粒細胞浸潤。同時出現(xiàn)下氣道高反應(yīng)性，肺組織有EOS浸潤，BALF中炎癥細胞比例增高。 結(jié)論：單純的上氣道炎癥可誘發(fā)下氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性，說明下氣道可在沒有變應(yīng)原

15、直接接觸的情況下出現(xiàn)氣道高反應(yīng)性。 分題3單純下氣道變應(yīng)性炎癥對上氣道反應(yīng)性的影響 方法：BALB/c小鼠腹腔OVA（100μg）致敏并經(jīng)氣管注射OVA（200μg）激發(fā)建立單純的下氣道變應(yīng)性炎癥模型，檢測鼻氣道的阻力及反應(yīng)性，并檢測肺阻力，與對照組進行比較。應(yīng)用ELISA試劑盒檢測NLF、BALF和血清中的IL-5，氣道功能檢測后進行鼻和肺病理組織學分析。 結(jié)果：經(jīng)氣管注射伊文思藍溶液后發(fā)現(xiàn)絕大部分溶液分布在小

16、鼠下氣道，而在鼻腔的分布與脾臟的分布無差異。小鼠出現(xiàn)下氣道炎癥伴有下氣道高反應(yīng)性，肺組織和BALF中有明顯的EOS浸潤，血清和BALF的IL-5中明顯增高。鼻組織學和NLF顯示鼻黏膜沒有明顯的嗜酸性粒細胞浸潤，與對照組無差異。對照組的基礎(chǔ)鼻阻力和組胺激發(fā)后的鼻阻力與單純下氣道炎癥組比較差異無統(tǒng)計學意義。末次激發(fā)后12、24、72h鼻灌洗液中的IL-5水平與對照組均無明顯差異（P>0.05）。 結(jié)論：單純下氣道炎癥不能誘發(fā)上氣道炎

17、癥和高反應(yīng)性。 總結(jié)： 1.采用不同大小變應(yīng)原顆粒霧化吸入的方法率先建立了率先成功建立了無氣道高反應(yīng)性但有嗜酸性粒細胞氣道炎癥的小鼠模型，為探討氣道高反應(yīng)性的發(fā)生機制奠定了基礎(chǔ)。 2.通過哮喘模型與該模型的比較，發(fā)現(xiàn)了谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶M1、熱休克蛋白B1等多個可能參與氣道高反應(yīng)性的差異表達蛋白。 3.在國內(nèi)外首次建立了新的小鼠鼻阻力及反應(yīng)性的檢測方法，該方法操作簡易、可靠，并建立了小鼠鼻灌洗方法學。