氣道高反應(yīng)性發(fā)生條件及機(jī)制的探討.pdf

1、氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性是哮喘的基本特征。哮喘患者是否上氣道在沒(méi)有直接接觸變應(yīng)原的情況下出現(xiàn)氣道炎癥和反應(yīng)性增高？這對(duì)于研究氣道高反應(yīng)性的發(fā)生條件和機(jī)制有很好的啟發(fā)作用，也具有很重要的臨床意義。 研究目的： 應(yīng)用不同大小的變應(yīng)原顆粒霧化小鼠，嘗試建立具有明顯的EOS氣道炎癥、但無(wú)氣道高反應(yīng)性的BALB/c小鼠模型，并將該模型與哮喘模型進(jìn)行病理學(xué)及蛋白組學(xué)的比較，以篩選鑒定與氣道高反應(yīng)性、氣流可逆性阻塞相關(guān)的蛋白，為進(jìn)一步研

2、究氣道炎癥及氣道高反應(yīng)性的發(fā)生機(jī)制奠定基礎(chǔ)；對(duì)小鼠氣道不同部位進(jìn)行變應(yīng)原激發(fā)，探討遠(yuǎn)端氣道在無(wú)變應(yīng)原直接刺激的情況下的氣道炎癥和反應(yīng)性。 研究?jī)?nèi)容： 第一部分不同直徑變應(yīng)原對(duì)小鼠氣道高反應(yīng)性的影響及蛋白組學(xué)的比較 分題1應(yīng)用大顆粒變應(yīng)原霧化建立無(wú)氣道高反應(yīng)性的嗜酸粒細(xì)胞性氣道炎癥小鼠模型及與哮喘模型氣道炎癥的比較 方法：BALB/c雌性小鼠，分為3組，每組6～8只：大顆粒變應(yīng)原霧化激發(fā)組（下稱實(shí)驗(yàn)組，霧化

3、顆粒的平均中位直徑8.6μm）、小顆粒變應(yīng)原霧化激發(fā)組（下稱哮喘組，霧化顆粒的平均中位直徑2.9μm）、生理鹽水對(duì)照組（下稱對(duì)照組）。致敏方法：第0、7、14天OVA（10μg）腹腔注射。實(shí)驗(yàn)組第28、29、30天用PARI TIA噴霧器霧化I%OVA15min激發(fā)；哮喘組第28、29、30天用PARI LC STAR噴霧器霧化1%OVA15min激發(fā)；對(duì)照組致敏、激發(fā)采用生理鹽水。最后一次激發(fā)24、48、72、96h后應(yīng)用美國(guó)BUXC

4、O公司的有創(chuàng)氣道阻力與肺順應(yīng)性檢測(cè)系統(tǒng)（RC system）測(cè)定動(dòng)物的氣道反應(yīng)性，并進(jìn)行支氣管肺泡灌洗觀察氣道炎癥情況。在末次激發(fā)24和96h后，檢測(cè)小鼠的氣道炎癥程度，按照氣道周圍EOS浸潤(rùn)的程度評(píng)0～4分，并觀察肺實(shí)質(zhì)的炎癥情況。 結(jié)果：1.氣道反應(yīng)性的測(cè)定：末次激發(fā)24、48、72、96h后，各組RL均有隨Mch濃度升高而增加的趨勢(shì)。哮喘組在各個(gè)濃度Mch的RL均高于實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，表明哮喘組的氣道反應(yīng)性高于實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組

5、，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的氣道反應(yīng)性差異在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2.實(shí)驗(yàn)組和哮喘組肺泡灌洗液中巨噬細(xì)胞百分率顯著低于對(duì)照組（P<0.05），而中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞百分率顯著高于對(duì)照組（P<0.01）。 3.末次激發(fā)72、96h后，實(shí)驗(yàn)組肺泡灌洗液中EOS比例逐步下降，表明具有明顯的嗜酸性粒細(xì)胞氣道炎癥、但無(wú)氣道高反應(yīng)性的BALB/c小鼠模型的氣道炎癥有逐步減輕的趨勢(shì)，但并未觀察到氣道反應(yīng)性的變化。 4

6、.末次激發(fā)24h后，哮喘組出現(xiàn)顯著的支氣管周圍EOS等炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡管及肺泡內(nèi)可見(jiàn)EOS浸潤(rùn)，而實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)輕度的支氣管周圍EOS等炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡管及肺泡內(nèi)無(wú)EOS浸潤(rùn)炎癥，末次激發(fā)24h后哮喘組氣道炎癥病理評(píng)分（3.15±0.21）顯著高于實(shí)驗(yàn)組（1.75±0.07，P<0.05），末次激發(fā)后96h后哮喘組氣道炎癥病理評(píng)分（2.65±0.11）仍然顯著高于實(shí)驗(yàn)組（1.15±0.05，P<0.05）。 5.末次激發(fā)24～9

7、6h后，哮喘組肺泡管及肺泡內(nèi)均可見(jiàn)EOS浸潤(rùn)，而實(shí)驗(yàn)組肺泡管及肺泡內(nèi)均無(wú)EOS浸潤(rùn)炎癥。 結(jié)論：通過(guò)應(yīng)用大顆粒變應(yīng)原進(jìn)行霧化激發(fā)，本實(shí)驗(yàn)初步成功建立了具有明顯的嗜酸性粒細(xì)胞氣道炎癥、但無(wú)氣道高反應(yīng)性的BALB/c小鼠模型，其氣道炎癥程度輕于哮喘模型組，氣道炎癥主要在大氣道周圍，接近EB的臨床病理特征。該模型為進(jìn)一步研究氣道高反應(yīng)性的發(fā)生機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。 分題2嗜酸粒細(xì)胞性支氣管炎小鼠模型與哮喘小鼠模型蛋白組學(xué)差異表達(dá)的初

8、步探討 方法：建立具有明顯的嗜酸性粒細(xì)胞氣道炎癥、但無(wú)氣道高反應(yīng)性的BALB/c小鼠模型、哮喘模型及對(duì)照小鼠各4只，激發(fā)后24h處死取肺組織提取總蛋白質(zhì)，利用固相pH梯度（immobilized pH gradient，IPG），雙向凝膠電泳（two-dimensional electrophoresis，2-DE）對(duì)總蛋白進(jìn)行分離，然后行考馬斯亮藍(lán)染色，予ImageMaster2D Elite5.0分析軟件進(jìn)行凝膠圖像分析，尋

9、找無(wú)氣道高反應(yīng)性的小鼠模型、哮喘模型和正常對(duì)照組差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。應(yīng)用基質(zhì)輔助電離解析飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assitsted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行序列分析，明確是何種蛋白質(zhì)。 結(jié)果：雙向電泳圖像對(duì)比分析表明，實(shí)驗(yàn)組與哮喘組和正常對(duì)照組肺組織蛋白表達(dá)有一定的差異。經(jīng)質(zhì)譜檢測(cè)肽質(zhì)量指紋譜

10、與標(biāo)準(zhǔn)分子量、等電點(diǎn)對(duì)照分析鑒定出20個(gè)蛋白，分別為谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶M1（GSTMI）、熱休克蛋白B1等，其中熱休克蛋白B1在哮喘組表達(dá)上調(diào)、GSTM1表達(dá)下調(diào)。 結(jié)論：電泳圖像對(duì)比分析表明，實(shí)驗(yàn)組與哮喘組之間肺組織蛋白表達(dá)存在一定的差異。成功鑒定了該模型和哮喘模型之間的差異表達(dá)蛋白，其中GSTM1、熱休克蛋白B1等可能參與氣道高反應(yīng)性的發(fā)生機(jī)制。 第二部分氣道不同部位激發(fā)對(duì)小鼠氣道高反應(yīng)性的影響 分題1小鼠

11、上氣道阻力及反應(yīng)性檢測(cè)方法的建立 方法：建立變應(yīng)性鼻炎小鼠模型，滴鼻激發(fā)后麻醉，分離氣管，胸廓開(kāi)口處氣管切開(kāi)插管，近喉部氣管切開(kāi)插入18G插管進(jìn)入鼻咽部，插管連接“T”形管，一端連接壓力傳感器，一端連接精密注射泵，應(yīng)用灌注／吸引模型模擬呼氣／吸氣，流量1mL/s，檢測(cè)鼻氣道的壓力差，計(jì)算出總阻力，并減去插管阻力得出鼻阻力，并對(duì)鼻腔進(jìn)行組胺霧化激發(fā)，激發(fā)后3min檢測(cè)阻力變化。兩組的肺阻力也進(jìn)行比較。氣道功能檢測(cè)后進(jìn)行鼻灌洗收集鼻

12、灌洗液（NLF）及鼻病理組織學(xué)分析。 結(jié)果：鼻組織學(xué)顯示鼻黏膜有明顯的嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，對(duì)照組的基礎(chǔ)鼻阻力為1.791±0.08 cm H2O ml-1 s-1，組胺激發(fā)后為3.037±0.48 cm H2O ml-1 s-1，鼻炎模型組的基礎(chǔ)鼻阻力為3.659±0.39 cm H2O ml-1 s-1，組胺激發(fā)后為7.643±1.41 cmH2O ml-1 s-1，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.01）。對(duì)照組肺阻力為1.68

13、1±0.11 cmH2O ml-1 s-1。 結(jié)論：我們成功建立了小鼠體內(nèi)的鼻氣道阻力及反應(yīng)性檢測(cè)方法，鼻阻力約占全氣道阻力的50%以上，變應(yīng)性鼻炎小鼠模型阻力和反應(yīng)性明顯增高，鼻黏膜腫脹是鼻阻力增高的因素。 分題2單純上氣道變應(yīng)性炎癥對(duì)下氣道反應(yīng)性的影響 方法：BALB/c小鼠腹腔OVA（100μg）致敏并在清醒狀態(tài)下OVA（200μg）滴鼻激發(fā)，建立單純的上氣道變應(yīng)性炎癥模型，檢測(cè)鼻氣道的阻力和反應(yīng)性，同時(shí)檢

14、測(cè)下氣道阻力及反應(yīng)性，與對(duì)照組進(jìn)行比較。兩組均進(jìn)行鼻和肺病理組織學(xué)分析。 結(jié)果：清醒狀態(tài)下經(jīng)鼻滴伊文思藍(lán)溶液后發(fā)現(xiàn)絕大部分溶液分布在鼻腔，而在肺的分布與脾臟的分布無(wú)差異。單純上氣道炎癥組出現(xiàn)明顯的鼻阻力增加和反應(yīng)性增高，鼻組織學(xué)和NLF顯示鼻黏膜有明顯的嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。同時(shí)出現(xiàn)下氣道高反應(yīng)性，肺組織有EOS浸潤(rùn)，BALF中炎癥細(xì)胞比例增高。 結(jié)論：?jiǎn)渭兊纳蠚獾姥装Y可誘發(fā)下氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性，說(shuō)明下氣道可在沒(méi)有變應(yīng)原

15、直接接觸的情況下出現(xiàn)氣道高反應(yīng)性。 分題3單純下氣道變應(yīng)性炎癥對(duì)上氣道反應(yīng)性的影響 方法：BALB/c小鼠腹腔OVA（100μg）致敏并經(jīng)氣管注射OVA（200μg）激發(fā)建立單純的下氣道變應(yīng)性炎癥模型，檢測(cè)鼻氣道的阻力及反應(yīng)性，并檢測(cè)肺阻力，與對(duì)照組進(jìn)行比較。應(yīng)用ELISA試劑盒檢測(cè)NLF、BALF和血清中的IL-5，氣道功能檢測(cè)后進(jìn)行鼻和肺病理組織學(xué)分析。 結(jié)果：經(jīng)氣管注射伊文思藍(lán)溶液后發(fā)現(xiàn)絕大部分溶液分布在小

16、鼠下氣道，而在鼻腔的分布與脾臟的分布無(wú)差異。小鼠出現(xiàn)下氣道炎癥伴有下氣道高反應(yīng)性，肺組織和BALF中有明顯的EOS浸潤(rùn)，血清和BALF的IL-5中明顯增高。鼻組織學(xué)和NLF顯示鼻黏膜沒(méi)有明顯的嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，與對(duì)照組無(wú)差異。對(duì)照組的基礎(chǔ)鼻阻力和組胺激發(fā)后的鼻阻力與單純下氣道炎癥組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。末次激發(fā)后12、24、72h鼻灌洗液中的IL-5水平與對(duì)照組均無(wú)明顯差異（P>0.05）。 結(jié)論：?jiǎn)渭兿職獾姥装Y不能誘發(fā)上氣道炎

17、癥和高反應(yīng)性。 總結(jié)： 1.采用不同大小變應(yīng)原顆粒霧化吸入的方法率先建立了率先成功建立了無(wú)氣道高反應(yīng)性但有嗜酸性粒細(xì)胞氣道炎癥的小鼠模型，為探討氣道高反應(yīng)性的發(fā)生機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。 2.通過(guò)哮喘模型與該模型的比較，發(fā)現(xiàn)了谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶M1、熱休克蛋白B1等多個(gè)可能參與氣道高反應(yīng)性的差異表達(dá)蛋白。 3.在國(guó)內(nèi)外首次建立了新的小鼠鼻阻力及反應(yīng)性的檢測(cè)方法，該方法操作簡(jiǎn)易、可靠，并建立了小鼠鼻灌洗方法學(xué)。