辛伐他汀對(duì)COPD氣道炎癥和細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、[目的]
　　 慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一個(gè)日益嚴(yán)重的全球健康問(wèn)題，臨床實(shí)驗(yàn)表明，他汀類藥物能減少COPD患者的發(fā)病率和病死率。本研究用辛伐他汀對(duì)COPD大鼠進(jìn)行干預(yù)，從大鼠的一般狀況、肺組織病理變化等多個(gè)方面評(píng)價(jià)其作用；通過(guò)對(duì)支氣管肺泡灌洗液(BALF)和血清中主要炎性因子白介素-8(IL-8)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、C反應(yīng)蛋白(CRP

2、)的測(cè)定，探討辛伐他汀在慢性阻塞性肺疾病治療中的抗炎作用機(jī)制；通過(guò)測(cè)定肺組織凋亡細(xì)胞的數(shù)目及調(diào)亡相關(guān)因子(Caspase-3、eNOS、iNOS)蛋白和基因的表達(dá)，探討辛伐他汀對(duì)COPD大鼠肺組織細(xì)胞凋亡的影響及作用機(jī)制。本課題研究為慢性阻塞性肺疾病的臨床治療提供新的藥物選擇。
　　 [方法]
　　 1.采用熏香煙加氣管內(nèi)滴入脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)法建立大鼠COPD模型，將75只雄性Wi

3、star大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、COPD模型組和辛伐他汀治療組，治療組在造模兩周后給予辛伐他汀2.5mg/kg灌胃治療，每天1次，治療6周。
　　 2.觀察正常對(duì)照組、COPD模型組和辛伐他汀治療組大鼠的一般情況、體質(zhì)量增長(zhǎng)率，肺組織的病理改變(HE染色)，使用天狼星猩紅染色及三聯(lián)染色觀察大鼠肺組織膠原情況。
　　 3.支氣管肺泡灌洗液(BALF)細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類。
　　 4.使用酶聯(lián)免疫法(ELISA)分別測(cè)定B

4、ALF中白介素-8(IL-8)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的水平，血清中IL-8、TNF-α、C反應(yīng)蛋白(CRP)的水平。
　　 5.采用免疫組化方法(SABC法)測(cè)定肺組織中IL-8、TNF-α炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。
　　 6.采用原位末端標(biāo)記技術(shù)(TUNEL法)檢測(cè)肺組織凋亡細(xì)胞。
　　 7.用免疫組化(SABC法)的方法檢測(cè)肺組織中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)、內(nèi)皮型一氧化氮合

5、酶(eNOS)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的蛋白表達(dá)。
　　 8.用RT-PCR的方法檢測(cè)肺組織中Caspase-3、eNOS、iNOS mRNA的表達(dá)。
　　 [結(jié)果]
　　 1.一般情況及體質(zhì)量增長(zhǎng)率
　　 觀察各組大鼠的被毛、活動(dòng)性、飲食、咳嗽等一般情況及體質(zhì)量增長(zhǎng)率，與模型組比較，治療組一般情況有所改善，體質(zhì)量增長(zhǎng)率顯著提高(P<0.01)。
　　 2.各組大鼠肺組織病理學(xué)變化

6、　　 正常對(duì)照組可見(jiàn)氣管黏膜纖毛柱狀上皮細(xì)胞完整，纖毛排列整齊，氣管及各級(jí)支氣管見(jiàn)少量杯狀細(xì)胞，氣道結(jié)構(gòu)未見(jiàn)異常，周?chē)鼙谖匆?jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡大小正常，結(jié)構(gòu)完整。
　　 模型組可見(jiàn)肺氣腫形成，氣管、支氣管黏膜上皮纖毛倒伏，部分上皮脫落，杯狀細(xì)胞增生，粘膜下層及肌層大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，部分腺泡萎縮，血管周?chē)^多炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，毛細(xì)血管充血，肺泡結(jié)構(gòu)不完整，肺泡壁變薄、斷裂，肺泡間隔可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　 辛伐他汀治

7、療組可見(jiàn)肺氣腫形成，但氣道上皮細(xì)胞脫落、杯狀細(xì)胞增多、氣管及血管周?chē)装Y細(xì)胞浸潤(rùn)等方面較模型組均有不同程度減輕。
　　 3.天狼星猩紅染色觀察各組大鼠肺組織膠原情況
　　 模型組及治療組大鼠支氣管壁黃紅色的Ⅰ型膠原較正常組顯著增多，主要沉積在氣道壁。伴行的肺小動(dòng)脈壁Ⅰ型膠原亦明顯增多，平滑肌顯著增厚，管腔縮小。圖像定量分析顯示：與正常組相比，模型組及治療組Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維IOD值升高(P<0.01)；與模型組比較，治療組

8、Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維IOD值明顯降低(P<0.01)。與正常組相比，模型組及治療組Ⅰ/Ⅲ型膠原的面積比例顯著上升(P<0.01)。與模型組相比，治療組Ⅰ/Ⅲ型膠原的面積比例顯著下降(P<0.01)。
　　 4.三聯(lián)染色觀察各組大鼠肺組織膠原
　　 與正常對(duì)照組相比，模型組及治療組小氣道及中等氣道壁紅染膠原沉積顯著增多(P<0.01)，氣道固有膜膠原與高聳的上皮皺褶一起凸入管腔，外膜膠原延伸至周?chē)伍g質(zhì)。治療組小氣道及中等氣道

9、壁膠原沉積較模型組顯著減輕(P<0.01)。與正常對(duì)照組相比，模型組和治療組肺平均內(nèi)襯間隔(Mean linear intercept，MLI)增大(P<0.01)，平均肺泡數(shù)(Mean alveolar numbers，MAN)減少(P<0.01)；與模型組相比，治療組MLI減小(P<0.01)，MAN增多(P<0.01)。
　　 5.各組大鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)和分類
　　 細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞比例、單核-巨噬細(xì)胞比例

10、、淋巴細(xì)胞比例在三組間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與正常對(duì)照組比較，模型組和治療組中細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞比例均升高(P<0.01)；與模型組比較，治療組細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞比例顯著下降(P<0.01)。
　　 6.各組大鼠BALF中IL-8、TNF-α的濃度
　　 IL-8、TNF-α的濃度在三組間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與正常對(duì)照組比較，模型組及治療組BALF中的IL-8、TNF-α水平均顯著升

11、高(P<0.01)；與模型組比較，治療組中IL-8、TNF-α濃度均降低(P<0.01)。
　　 7.各組大鼠血清中IL-8、TNF-α、CRP的濃度
　　 IL-8、TNF-α、CRP濃度在三組間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與正常對(duì)照組比較，模型組及治療組IL-8、TNF-α、CRP濃度均顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，治療組IL-8、TNF-α、CRP濃度均降低(P<0.05)。
　　 8.

12、各組BALF中性粒細(xì)胞比例和IL-8濃度之間的相關(guān)性分析
　　 正常對(duì)照組BALF中性粒細(xì)胞比例和IL-8濃度的無(wú)相關(guān)性關(guān)系(r=0.043，P>0.05)，COPD模型組BALF中性粒細(xì)胞比例和IL-8濃度有顯著正相關(guān)(r=0.757，P<0.01，相關(guān)方程為y=0.654x+13.996)，辛伐他汀治療組BALF中性粒細(xì)胞比例和IL-8濃度有顯著正相關(guān)(r=0.592，P<0.01，相關(guān)方程為y=0.547x+14.261)

13、。
　　 9.各組BALF中性粒細(xì)胞比例和TNF-α濃度之間的相關(guān)性分析
　　 正常對(duì)照組BALF中性粒細(xì)胞比例和TNF-α濃度的無(wú)相關(guān)性關(guān)系(r=0.062，P>0.05)，COPD模型組BALF中性粒細(xì)胞比例和TNF-α濃度有無(wú)相關(guān)性關(guān)系(r=0.139，P>0.05)，辛伐他汀治療組BALF中性粒細(xì)胞比例和TNF-α濃度無(wú)相關(guān)性關(guān)系(r=0.202，P>0.05)。
　　 10.各組大鼠肺組織中IL-8、T

14、NF-α的表達(dá)
　　 與正常對(duì)照組相比，模型組及治療組表達(dá)增多(P<0.05)，治療組與模型組相比，IL-8的表達(dá)減少(P<0.05)；TNF-α主要表達(dá)于肺泡巨噬細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等，與正常對(duì)照組相比，模型組及治療組表達(dá)增多(P<0.05)，治療組與模型組相比，TNF-α的表達(dá)減少(P<0.05)。
　　 11.各組大鼠肺組織細(xì)胞凋亡
　　 與正常對(duì)照組相比，模型組和治療組氣道上皮細(xì)胞及肺泡上皮

15、細(xì)胞凋亡增加(P<0.01)；治療組與模型組相比肺泡上皮細(xì)胞和氣道上皮細(xì)胞凋亡減少(P<0.01)。
　　 12.各組大鼠肺組織中凋亡相關(guān)因子(caspase-3，iNOS，eNOS)mRNA的表達(dá)
　　 與正常對(duì)照組大鼠肺組織相比，模型組及治療組Caspase-3及iNOS mRNA表達(dá)增多(P<0.01)，與模型組大鼠肺組織相比，治療組Caspase-3及iNOS mRNA表達(dá)減少(P<0.01)；與正常對(duì)照組大鼠肺

16、組織相比，模型組及治療組eNOS mRNA表達(dá)減少(P<0.01)，與模型組大鼠肺組織相比，治療組eNOS mRNA表達(dá)增多(P<0.01)。
　　 13.各組大鼠肺組織中凋亡相關(guān)因子(caspase-3，iNOS，eNOS)的表達(dá)
　　 Caspase-3主要表達(dá)于氣道上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、血管和氣道平滑肌細(xì)胞，與正常組對(duì)照相比，模型組及治療組表達(dá)增多(P<0.01)，治療組與模型組相比，Caspase-3的表達(dá)減少

17、(P<0.01)；eNOS的表達(dá)主要分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞和氣道上皮細(xì)胞，與正常對(duì)照組相比，模型組及治療組eNOS的表達(dá)減少(P<0.01)，與模型組相比，治療組eNOS表達(dá)增多(P<0.01)；iNOS的表達(dá)主要分布于氣道上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及氣道和血管的平滑肌細(xì)胞，與正常對(duì)照組相比，模型組和治療組iNOS表達(dá)增多(P<0.05)，治療組與模型組相比，iNOS表達(dá)減少(P<0.01)。
　　 14.凋亡相關(guān)因子(caspase-3

18、，iNOS，eNOS)的相關(guān)性分析
　　 正常對(duì)照組、模型組及治療組大鼠Caspase-3、iNOS、eNOS基因表達(dá)及蛋白表達(dá)呈Caspase-3與iNOS正相關(guān)，與eNOS負(fù)相關(guān)。
　　 [結(jié)論]
　　 1.COPD模型大鼠中肺組織炎癥反應(yīng)及肺組織膠原沉積增加，肺泡上皮及氣道上皮細(xì)胞凋亡增加，Caspase-3、iNOS的基因及蛋白表達(dá)增加，eNOS相應(yīng)減少，三者存在相關(guān)性。
　　 2.辛伐他汀可以改

19、善COPD大鼠的一般狀況，提高體質(zhì)量增長(zhǎng)率，減輕支氣管及肺血管周?chē)准?xì)胞浸潤(rùn)及肺組織內(nèi)膠原沉積。辛伐他汀可能對(duì)COPD大鼠有一定療效，有望為COPD的治療提供新的藥物選擇。
　　 3.辛伐他汀可以通過(guò)抑制肺組織、BALF及血清中炎性因子(IL-8、TNF-α、CRP)的表達(dá)，減輕COPD大鼠肺組織炎性反應(yīng)。
　　 4.辛伐他汀可以通過(guò)增加eNOS和抑制iNOS蛋白及基因的表達(dá)，進(jìn)而減少促調(diào)亡因子Caspase-3的表達(dá)，