病原真菌入侵蚧蟲(chóng)過(guò)程中胞外酶變化和血淋巴的免疫機(jī)制.pdf

1、蚧蟲(chóng)屬于昆蟲(chóng)綱(1nsecta)，半翅目(Hemiptera)，蚧總科(Coccoidea)，全世界已記錄49科7500余種，我國(guó)有16科830余種，是許多農(nóng)林、果樹(shù)和花卉的重要害蟲(chóng)。目前化學(xué)殺蟲(chóng)劑是防治蚧蟲(chóng)的主要手段，但蚧蟲(chóng)體表的保護(hù)性蠟殼給化學(xué)防治帶來(lái)極大困難，應(yīng)用昆蟲(chóng)病原真菌進(jìn)行生物防治是一個(gè)重要的發(fā)展方向。近年來(lái)已有對(duì)蚧蟲(chóng)病原真菌和病理學(xué)的相關(guān)報(bào)道，但病原真菌和蚧蟲(chóng)相互作用以及蚧蟲(chóng)對(duì)病原真菌的免疫研究還很少。
　　本研究分

2、為三部分：
　　1.選擇4株昆蟲(chóng)病原真菌——蠟蚧霉Lecanicillium lecanii菌株V3.4505和菌株V3.4504，噬菌蚧霉 Lecanicillium fungicola菌株 HEB02和鐮刀菌 Fusarium incarnatum-equiseti菌株HEB01侵染兩種蚧蟲(chóng)——日本龜蠟蚧Ceroplastes japonicus Green和蘋果球蚧Rhodococcus sariuoni Borchseni

3、us。以這兩種蚧蟲(chóng)的表皮為唯一碳源培養(yǎng)真菌，測(cè)定了入侵體壁過(guò)程中菌株的脂肪酶、類枯草桿菌蛋白酶（Pr1酶）、幾丁質(zhì)酶和N-乙酰-氨基葡萄糖酶（NAG酶）的活性變化，分析了四種酶在降解蚧蟲(chóng)體壁過(guò)程中的作用；并結(jié)合4個(gè)株菌感染兩種蚧蟲(chóng)8d后的累積死亡率，評(píng)價(jià)菌株對(duì)蚧蟲(chóng)的毒力。
　　2.采用相差、熒光及透射電鏡顯微技術(shù)，研究了日本龜蠟蚧雌成蟲(chóng)血細(xì)胞的種類及其比例，以及蠟蚧霉Lecanicillium lecanii菌株V3.4505感染

4、蚧蟲(chóng)后的細(xì)胞免疫反應(yīng)。
　　3.采用細(xì)胞化學(xué)標(biāo)記技術(shù)，應(yīng)用透射電鏡對(duì)蚧蟲(chóng)血淋巴中的過(guò)氧化物酶（POD）和酚氧化酶（PO）進(jìn)行了化學(xué)定位，比較了染菌前后兩種保護(hù)酶在血淋巴中的含量和分布變化情況。
　　結(jié)果如下：
　　1.四株真菌降解蚧蟲(chóng)體壁過(guò)程中四種胞外酶的作用
　　將上述四個(gè)菌株制備成濃度為1×108孢子/mL的孢子懸浮液，以兩種蚧蟲(chóng)的表皮為底物培養(yǎng)上述四種真菌，培養(yǎng)過(guò)程中1-8d的脂肪酶、Pr1酶、幾丁質(zhì)酶和N

5、AG酶的活性變化測(cè)定結(jié)果顯示：
　　4株病原菌在降解兩種蚧蟲(chóng)的體壁過(guò)程中，4種胞外酶的活性都發(fā)生了明顯的變化，呈現(xiàn)為先升高后降低趨勢(shì)。脂肪酶的活性高峰出現(xiàn)得最早，在培養(yǎng)2d后就達(dá)到最大值，這是由于蠟層位于體壁最上層。各菌株脂肪酶的活性在日本龜蠟蚧上明顯高于蘋果球蚧，這是由于日本龜蠟蚧體表的蠟殼明顯厚于蘋果球蚧。菌株的Pr1酶活性高峰出現(xiàn)在3-4d，而幾丁質(zhì)酶和NAG酶的活性高峰分別出現(xiàn)在6 d和4-5d，酶活高峰與它們?cè)隍幌x(chóng)體壁中

6、蛋白質(zhì)和幾丁質(zhì)的排列層次相一致。4個(gè)菌株相比較， V3.4505菌株對(duì)日本龜蠟蚧和蘋果球蚧的致死率均為最高，分別是73％和81%，且與HEB02菌株和HEB01菌株的差異顯著。4個(gè)菌株的Pr1酶活性平均值與它們對(duì)日本龜蠟蚧和蘋果球蚧感染8d后的累計(jì)死亡率之間呈顯著的線性相關(guān)，線性方程分別為：y=0.082x+5.822（R2=0.823）和y=0.119x+14.75（R2=0.764）；4個(gè)菌株的幾丁質(zhì)酶活性平均值與兩種蚧蟲(chóng)累計(jì)死亡率

7、之間的線性方程分別為：y=0.148x+15.89（R2=0.645）和y=0.095x+10.46（R2=0.762）。說(shuō)明病原真菌的Pr1酶和幾丁質(zhì)酶在降解蚧蟲(chóng)的體壁過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，可作為病原真菌的毒力指標(biāo)。
　　2.日本龜蠟蚧的血細(xì)胞及受蠟蚧霉感染的細(xì)胞免疫
　　為研究日本龜蠟蚧雌成蟲(chóng)血淋巴的免疫，在光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡下對(duì)日本龜蠟蚧的血細(xì)胞進(jìn)行了形態(tài)觀察和數(shù)量統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)血淋巴中有4種類型的血細(xì)胞，包括原血細(xì)胞

8、占24.6%，漿細(xì)胞占36.6%，粒細(xì)胞占13.2%，類絳色細(xì)胞占25.6%。
　　將Lecanicillium lecanii菌株V3.4505制備成濃度為1×108孢子/mL的孢子懸浮液，噴灑到日本龜蠟蚧表面。染菌后第2天觀察到日本龜蠟蚧表面開(kāi)始出現(xiàn)稀薄菌絲，到5d時(shí)蟲(chóng)體發(fā)黑死亡。取感染2-5d后的蚧蟲(chóng)血淋巴在相差和熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)3d時(shí)血細(xì)胞與真菌間的相互作用最強(qiáng)，在相差顯微鏡和熒光顯微鏡下可明顯觀察到漿細(xì)胞對(duì)孢子的粘

9、連和吞噬作用，并且在熒光顯微鏡下看到類絳色細(xì)胞吞噬孢子的行為；取感染3d后的日本龜蠟蚧血細(xì)胞進(jìn)行透射電鏡觀察，可看到血細(xì)胞內(nèi)部的超微結(jié)構(gòu)的變化，包括細(xì)胞內(nèi)部空泡化，雙層核膜分離，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)變形等現(xiàn)象。感染真菌前后，日本龜蠟蚧血淋巴中的血細(xì)胞類型沒(méi)有發(fā)生變化，但感染后各血細(xì)胞比例發(fā)生了變化，其中原血細(xì)胞的數(shù)量下降了13.7%，但漿細(xì)胞、粒細(xì)胞和類絳色細(xì)胞數(shù)量分別上升了6.3%，1.8%和5.6%，說(shuō)明漿細(xì)胞和類絳色細(xì)胞可能在蚧蟲(chóng)的免疫中發(fā)

10、揮了重要作用。
　　3.日本龜蠟蚧血淋巴中酚氧化酶（PO）和過(guò)氧化物酶（POD）的細(xì)胞化學(xué)定位
　　經(jīng)過(guò)多巴與血淋巴中酚氧化酶的特異性反應(yīng)，在透射電鏡下觀察到真菌感染的日本龜蠟蚧血細(xì)胞內(nèi)部有很多強(qiáng)陽(yáng)性的酚氧化酶顆粒，而在真菌內(nèi)部并未發(fā)現(xiàn)。經(jīng)過(guò)二氨基聯(lián)苯胺（DAB）作用標(biāo)記，在透射電鏡下觀察到受損血細(xì)胞內(nèi)部和真菌孢子內(nèi)部都有強(qiáng)陽(yáng)性的過(guò)氧化物酶顆粒。與未染菌的相比，染菌后的血細(xì)胞中酚氧化酶和過(guò)氧化物酶顆粒在數(shù)量及強(qiáng)度上均較高，說(shuō)