弓形蟲(chóng)入侵轉(zhuǎn)化過(guò)程中宿主Rac1及蟲(chóng)體DNA甲基化的作用研究.pdf

1、弓形蟲(chóng)是一種機(jī)會(huì)性致病原蟲(chóng)，人和其他溫血?jiǎng)游锞赏ㄟ^(guò)多種途徑被感染。弓形蟲(chóng)入侵宿主細(xì)胞的過(guò)程主要包括粘附細(xì)胞膜，納蟲(chóng)泡(PV)的形成等。中間宿主感染后，弓形蟲(chóng)可實(shí)現(xiàn)速殖子向緩殖子的轉(zhuǎn)化，形成慢性感染;當(dāng)宿主免疫力低下時(shí)，緩殖子則會(huì)向速殖子轉(zhuǎn)化，引起急性發(fā)病。目前關(guān)于弓形蟲(chóng)入侵及速、緩殖子相互轉(zhuǎn)化機(jī)制尚不完全清楚。
　　目的:宿主Rac1在細(xì)胞骨架重組中扮演著重要的角色，以往研究發(fā)現(xiàn)弓形蟲(chóng)入侵宿主細(xì)胞過(guò)程中Rac1在納蟲(chóng)泡膜(PVM

2、)上存在聚集現(xiàn)象。DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾方式，主要參與物種表型的可塑性和適應(yīng)性。本研究著重探討弓形蟲(chóng)入侵轉(zhuǎn)化過(guò)程中宿主Rac1及蟲(chóng)體DNA甲基化的作用。
　　方法:Rac1抑制劑(NSC23766)處理HFF細(xì)胞后用RH-GHP-SAG1株弓形蟲(chóng)感染細(xì)胞，觀察統(tǒng)計(jì)弓形蟲(chóng)入侵效率。抑制劑處理細(xì)胞后觀察宿主actin在弓形蟲(chóng)感染時(shí)的重排現(xiàn)象。宿主Rac1與弓形蟲(chóng)ROP2共定位現(xiàn)象觀察。COS-7細(xì)胞中過(guò)表達(dá)CFP-Rac

3、1-WT后感染弓形蟲(chóng)，在不同的時(shí)間點(diǎn)統(tǒng)計(jì)Rac1陽(yáng)性PVs。Western blot檢測(cè)弓形蟲(chóng)感染后不同時(shí)間點(diǎn)Rac1磷酸化水平變化。NSC23766處理細(xì)胞后觀察抑制劑對(duì)弓形蟲(chóng)增殖的影響。
　　檢測(cè)核蛋白DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)活性。體外克隆表達(dá)弓形蟲(chóng)DNMT基因Tgdnmta和Tgdnmtb，純化重組表達(dá)的TgDNMTa和TgDNMTb并進(jìn)行DNMT活性檢測(cè)。qPCR檢測(cè)兩個(gè)基因在速、緩殖子的表達(dá)水平。弓形蟲(chóng)速、緩殖子全基

4、因組DNA甲基化高通量亞硫酸氫鹽測(cè)序。特定位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證。差異甲基化基因的生物信息學(xué)分析。DNMT抑制劑(5-AzaC)處理弓形蟲(chóng)后，觀察5-AzaC對(duì)其入侵增殖的影響。構(gòu)建弓形蟲(chóng)DNMTs敲除蟲(chóng)株。
　　結(jié)果:NSC23766處理細(xì)胞后弓形蟲(chóng)的入侵效率顯著低于正常組(p＜0.05)。正常細(xì)胞感染弓形蟲(chóng)時(shí)細(xì)胞骨架重組更活躍。宿主Rac1與弓形蟲(chóng)ROP2在PVM上共定位。弓形蟲(chóng)一旦開(kāi)始入侵便會(huì)招募Rac1向PVM聚集，隨著入侵時(shí)間

5、的延長(zhǎng)，Rac1會(huì)從PVM上消失。宿主細(xì)胞Rac1磷酸化水平隨著弓形蟲(chóng)感染時(shí)間的增加（0-6小時(shí)）而增強(qiáng)。長(zhǎng)期用NSC23766處理細(xì)胞會(huì)抑制弓形蟲(chóng)在PV增殖(p＜0.05)。
　　弓形蟲(chóng)存在兩個(gè)DNMT蛋白:TgDNMTa和TgDNMTb。重組表達(dá)的TgDNMTa和TgDNMTb蛋白均具有DNMT活性，兩個(gè)基因在緩殖子轉(zhuǎn)錄水平均高于速殖子。緩殖子甲基化位點(diǎn)多于速殖子。速、緩殖子存在差異DNA甲基化的基因主要參與一些基礎(chǔ)的能量代謝