利用Rni阻抑hTERT和Bi-1雙基因表達(dá)并誘導(dǎo)人鼻癌咽細(xì)胞凋亡的初步研究.pdf

1、[目的]
　　 鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我國(guó)華南地區(qū)的高發(fā)性惡性腫瘤，研究表明其發(fā)病除與EB病毒感染、化學(xué)致癌物有關(guān)外，與遺傳易感基因也有密切的關(guān)系。近年來(lái)，RNA干擾(RNA interference，RNAi)的研究進(jìn)展非常迅速，這項(xiàng)技術(shù)極有可能用于腫瘤臨床治療。本課題擬從基因治療的角度，以人類端粒酶末端逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcrip

2、tase，hTERT)和凋亡抑制基因Bax inhibitor-1(Bi-1)為靶點(diǎn)，針對(duì)hTERT和Bi-1基因設(shè)計(jì)并構(gòu)建表達(dá)shRNA的質(zhì)粒載體，利用LipofectaminTM2000(Lip)有效地將其轉(zhuǎn)染至鼻咽癌細(xì)胞內(nèi)，誘導(dǎo)序列特異性的基因沉默，旨在研究RNAi效應(yīng)對(duì)人鼻咽癌低分化細(xì)胞株CNE-2Z hTERT和Bi-1雙基因表達(dá)的抑制作用及其對(duì)細(xì)胞增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用，并將其與抑制單基因的作用效果相比較，探討鼻咽癌新的治療

3、策略。
　　 [方法]
　　 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室以前篩選出的hTERT和Bi-1最佳作用位點(diǎn)(hTERT，gi：38201699，2475-2493位；Bi-1，gi：23271944，738-760位)分別設(shè)計(jì)合成2對(duì)shRNAs(TR和Bi-1)，同時(shí)設(shè)計(jì)2對(duì)陰性序列(TRs和Bi-1s)，退火、定向克隆入含T7啟動(dòng)子的真核表達(dá)質(zhì)粒載體pcDNA3.1(+)中，構(gòu)建表達(dá)shRNA的系列重組質(zhì)粒載體，研究其產(chǎn)生的shRNA抑

4、制hTERT和Bi-1基因表達(dá)的效果，并觀察其誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞凋亡的情況。瓊脂糖凝膠電泳法初步篩選正確的重組克隆，DNA測(cè)序驗(yàn)證重組克隆的正確性；流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)轉(zhuǎn)染率；MTT法觀察質(zhì)粒載體及轉(zhuǎn)染試劑對(duì)CNE-2Z細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響；FCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡；Real-time PCR法分析表達(dá)shRNA重組質(zhì)粒載體對(duì)hTERT和Bi-1基因mRNA表達(dá)的抑制效應(yīng)，Western-blot分析重組質(zhì)粒載體對(duì)相關(guān)基因蛋白質(zhì)表達(dá)的抑制效果。

5、Hoechst33258染色，熒光顯微鏡觀察鼻咽癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化。
　　 [結(jié)果]
　　 DNA測(cè)序結(jié)果證實(shí)各重組質(zhì)粒的插入轉(zhuǎn)錄模板完全正確。Lip對(duì)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染率為40％～48.6％。分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)和6種shRNA的重組質(zhì)粒(TR、TRs、Bi-1、Bi-1s、TR-Bi-1、TRs-Bi-1s)后，TR、Bi-1和TR-Bi-1組的CNE-2Z細(xì)胞生長(zhǎng)增殖能力降低，且TR-Bi-1組的生長(zhǎng)增殖能力最低

6、；凋亡細(xì)胞有所增加。轉(zhuǎn)染TR、Bi-1和TR-Bi-1重組質(zhì)粒48h后，熒光顯微鏡下可見(jiàn)部分鼻咽癌細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)變化；可明顯下調(diào)hTERT和Bi-1的mRNA及蛋白表達(dá)水平；而pcDNA3.1(+)、TRs、Bi-1s、TRs-Bi-1s、Lip和空白對(duì)照組的mRNA和蛋白水平無(wú)明顯變化。
　　 [結(jié)論]
　　 成功構(gòu)建了針對(duì)人hTERT和Bi-1基因的shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒。構(gòu)建的重組質(zhì)粒能特異、有效地阻抑h