hTERT RNAi和外源性PUMA基因聯(lián)合作用促MCF-7細胞凋亡機制的初步研究.pdf

1、目的:構建靶向人端粒酶逆轉錄酶(hTERT)基因的RNA干擾(RNAi)真核表達載體和PUMA基因的真核表達載體,探討hTERT蛋白和PUMA蛋白在MCF-7細胞中表達的相關性及hTERT基因干擾和外源性PUMA基因聯(lián)合作用促MCF-7細胞凋亡的可能機制,為hTERT基因干擾和外源性PUMA基因聯(lián)合作用作為腫瘤基因治療策略的應用提供依據(jù)。
　　 方法:根據(jù)hTERT基因的RNA干擾靶序列GGAACACCAAGAAGTTCATCT

2、,設計合成具有該靶序列短發(fā)夾結構的寡核苷酸,退火形成雙鏈:DNA,并定向克隆到真核表達載體pYr-2.1-hU6形成重組質粒pYr-2.1-hTERT-shRNA。將重組質粒轉化感受態(tài)細胞DH5α,經(jīng)Kanar抗性篩選和CCDB致死基因篩選,挑選陽性克隆菌落進行搖菌擴增,并抽提純化質粒,然后將抽提的重組質粒進行SacI酶切和瓊脂糖電泳分析,同時做測序鑒定以確定插入的干擾片段準確無誤。同法構建不針對任何基因的shRNA陰性對照質粒pYr-

3、2.1-HK。將PUMA基因序列(gene bank NM_014417)克隆入質粒pYr-ads-1,構建PUMA真核表達質粒pYr-ads-1-PUMA,轉化感受態(tài)細胞DH5α,經(jīng)Kanar抗性篩選,挑選陽性克隆菌落進行搖菌擴增,并抽提純化質粒,然后將抽提的重組質粒進行BamHI和EcoRI雙酶切和瓊脂糖電泳分析,同時做測序鑒定以確定插入的PUMA基因片段準確無誤。用表達綠色熒光蛋白(EGFP)的質粒pYr-2.1-EGFP和表達紅

4、色熒光蛋白(RFP)的質粒pYr-ads—1—RFP檢測MCF-7細胞的轉染效率。實驗設6個組:空白對照組、hTERT陰性對照組、PUMA空載體對照組、pYr-2.1-hTERT-shRNA組、pYr-ads-1-PUMA組、pYr-2.1-hTERT-shRNA／pYr-ads-1-PUMA組,前五組分別以每孔脂質體10μl、質粒4μg配成轉染復合物,加入各組MCF-7細胞中進行轉染(空白對照組不加任何試劑),聯(lián)合組每孔pYr-2.1

5、-hTERT-shRNA和pYr-ads-1-PUMA各4μg,脂質體20μl。于轉染后48h裂解各組細胞提取總蛋白,通過Western blot檢測各組細胞hTERT、PUMA、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白的表達。
　　 結果:1.重組質粒pYr-2.1-hTERT-shRNA經(jīng)SacI酶切鑒定和測序鑒定證實目的序列已準確插入到預計位點,重組質粒構建成功。2.重組質粒pYr-ads-1-PUMA經(jīng)BamHI和Ec

6、oRI雙酶切鑒定和測序鑒定證實目的序列已準確插入到預計位點,重組質粒構建成功。3.轉染后48h熒光顯微鏡下觀察,根據(jù)發(fā)熒光的MCF-7細胞所占比率判斷LipofectamineTM2000轉染MCF-7細胞的轉染效率約60％。4.免疫印跡Western blot分析顯示:pYr-2.1-hTERT-shRNA組和pYr-2.1-hTERT-shRNA／pYr-ads-1-PUMA聯(lián)合組hTERT蛋白的相對表達量與三個對照組相比均下降約5

7、2％,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),與pYr-ads-1-PUMA組相比下降約53.5％,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而pYr-2.1-hTERT-shRNA組與pYr-2.1-hTERT-shRNA／pYr-ads-1-PUMA聯(lián)合組之間hTERT蛋白表達差異無顯著性(P>0.05),pYr-ads-1-PUMA組與三個對照組相比hTERT蛋白表達差異無顯著性(P>0.05):pYr-ads-1-PUMA組和pYr-2.

8、1-hTERT-shRNA／pYr-ads-1-PUMA聯(lián)合組PUMA蛋白的相對表達量與三個對照組相比均增加約145.3％,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),與pYr-2.1-hTERT-shRNA組相比增加約147.7％,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而pYr-ads-1-PUMA組與pYr-2.1-hTERT-shRNA／pYr-ads-1-PUMA聯(lián)合組之間PUMA蛋白表達差異無顯著性(P>0.05),pYr-2.1-hT

9、ERT-shRNA組與三個對照組相比PUMA蛋白表達差異無顯著性(P>0.05):pYr-2.1-hTERT-shRNA組和pYr-2.1-hTERT-shRNA／pYr-ads-1-PUMA聯(lián)合組Bcl-2蛋白的相對表達量與三個對照組相比均下降約25.1％,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),與pYr-ads-1-PUMA組相比下降約24.6％,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而pYr-2.1-hTERT-shRNA組與pYr-2

10、.1-hTERT-shRNA／pYr-ads-1-PUMA聯(lián)合組之間Bcl-2蛋白表達差異無顯著性(P>0.05),pYr-ads-1-PUMA組與三個對照組相比Bcl-2蛋白表達差異無顯著性(P>0.05)；pYr-2.1-hTERT-shRNA組和pYr-2.1-hTERT-shRNA／pYr-ads-1-PUMA聯(lián)合組Bax蛋白的相對表達量與三個對照組相比均增加約46.1％,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),與pYr-ads-1

11、-PUMA組相比增加約45.2％,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而pYr-2.1-hTERT-shRNA組與pYr-2.1-hTERT-shRNA／pYr-ads-1-PUMA聯(lián)合組之間Bax蛋白表達差異無顯著性(P>0.05),pYr-ads-1-PUMA組與三個對照組相比Bax蛋白表達差異無顯著性(P>0.05)；pYr-2.1-hTERT-shRNA組、pYr-ads-1-PUMA組、pYr-2.1-hTERT-shRNA／

12、pYr-ads-1-PUMA聯(lián)合組Caspase-3蛋白的相對表達量與三個對照組相比均下降,各分別下降約23％、43.3％、62.4％,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 結論:1.成功構建了hTERT基因的shRNA表達載體pYr-2.1-hTERT-shRNA和PUMA基因真核表達載體pYr-ads-1-PUMA,前者可有效抑制MCF-7細胞中hTERT蛋白表達,后者可明顯提高PUMA蛋白表達,但hTERT蛋白和PU