Velcade（bortezomib）誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的基因表達(dá)譜研究.pdf

1、本課題首先從形態(tài)學(xué)方面觀察了Velcade處理后K562細(xì)胞的變化，然后進(jìn)一步分析了K562細(xì)胞基因表達(dá)的改變。尋找差異基因的方法有很多種，如差異顯示技術(shù)、代表性差異分析、抑制性消減雜交、基因芯片等。其中基因芯片是近年來發(fā)展起來的一門新的基因分析技術(shù)，尤其是表達(dá)譜基因芯片，可對基因表達(dá)情況進(jìn)行全面、快速、敏感、高效的分析，因此本課題選用表達(dá)譜基因芯片作為研究工具。我們采用光鏡、DNA片段化檢測等方法，觀測了Velcade處理后正常K56

2、2細(xì)胞的各種變化。提取兩組細(xì)胞的基因組DNA，1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測。在光鏡下觀察Velcade處理后的K562細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖被部分抑制，有的細(xì)胞體積變小、變形，細(xì)胞核濃縮，但細(xì)胞膜完整。DNA片段化檢測結(jié)果顯示Velcade處理組細(xì)胞DNA電泳條帶呈典型的梯狀條帶，表明細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。研究發(fā)現(xiàn)Velcade可以有效地抑制K562增殖，使細(xì)胞增殖進(jìn)程受阻，并可導(dǎo)致部分K562細(xì)胞凋亡。 運(yùn)用基因芯片技術(shù)，檢測了Velcad

3、e處理后K562細(xì)胞的基因表達(dá)譜變化。首先提取對照組和Velcade處理組K562細(xì)胞的總RNA，采用Agilent BioAnalyzer2100進(jìn)行RNA樣品的質(zhì)量鑒定。采用Agilent低RNA熒光線性擴(kuò)增試劑盒對樣品進(jìn)行雙色熒光標(biāo)記：總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cRNA，以Cy3標(biāo)記對照組K562細(xì)胞，Cy5標(biāo)記Velcade處理組K562細(xì)胞，合成熒光標(biāo)記的cRNA，并對標(biāo)記的cRNA進(jìn)行純化。純化后的樣品和Agilent Human

4、1A60mer寡核苷酸基因芯片進(jìn)行雜交，雜交完畢后依次用漂洗緩沖液進(jìn)行芯片的漂洗。然后采用Agilent基因芯片掃描儀掃描，掃描后的數(shù)據(jù)采用Feature Extraction軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集及標(biāo)準(zhǔn)化處理。然后采用Panther數(shù)據(jù)庫對差異表達(dá)基因進(jìn)行生物學(xué)功能分析。最后采用半定量RT-PCR對有進(jìn)一步研究價值且表達(dá)改變顯著的基因Nras、Etv6進(jìn)行驗(yàn)證。在芯片22153個檢測點(diǎn)中，發(fā)現(xiàn)共同差異表達(dá)基因640個，其中29個基因表達(dá)上調(diào)

5、。KT-PCR結(jié)果表明與芯片雜交結(jié)果基本一致。Velcade處理后K562細(xì)胞基因表達(dá)譜的變化為：致癌基因表達(dá)下調(diào)?；虮磉_(dá)的總體變化趨勢是促進(jìn)凋亡、抑制增殖。 綜上所述，本研究采用Velcade處理K562細(xì)胞，DNA片段化檢測等手段，觀測了K562細(xì)胞的變化。研究表明，Velcade可以抑制K562細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)部分K562細(xì)胞凋亡。研究進(jìn)一步結(jié)合基因芯片技術(shù)，針對Velcade處理后K562細(xì)胞的基因表達(dá)譜進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)