hTERT基因在人表皮干細胞中的表達與調(diào)控研究.pdf

1、南昌大學博士學位論文hTERT基因在人表皮干細胞中的表達與調(diào)控研究姓名：王聯(lián)群申請學位級別：博士專業(yè)：外科學指導(dǎo)教師：劉德伍20100529中文摘要種細胞來延長細胞增殖壽命的成功嘗試，初步結(jié)果均表明顯著延長了細胞生命周期，并保持『F常表型且沒有惡性轉(zhuǎn)化傾向。皮膚發(fā)育生物學現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，在富含表皮干細胞的表皮基底層和生長期毛囊中均有端粒酶活性表達，提示端粒酶活性表達很可能與表皮干細胞增殖分化機制之問也存在著重要的內(nèi)在聯(lián)系。目前對體外培養(yǎng)的

2、人表皮干細胞端粒酶活性表達特征及其與表皮干細胞增殖分化的關(guān)系仍缺乏了解?；诖?，本課題采用表皮干細胞體外分離培養(yǎng)方法，觀察hTERT基因及其蛋白和端粒酶活性在人表皮干細胞中的表達特征，探討其對體外培養(yǎng)的人表皮干細胞生物學特性的作用及意義；采用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法，將構(gòu)建的攜人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和增強型綠色熒光蛋白雙基因的重組真核表達質(zhì)粒plRES2EGFPhTERT轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的人表皮干細胞，觀察hTERTmRNA轉(zhuǎn)錄及其蛋白的表達、端粒酶活性

3、和細胞生物學特性的變化，為其在皮肽組織工程中的應(yīng)用提供新思路和理論依據(jù)。第一部分人表皮干細胞體外培養(yǎng)、鑒定與端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶表達目的：觀察體外培養(yǎng)的人表皮干細胞hTERT基因及其蛋白和端粒酶活性的表達特征，探討其對表皮干細胞生物學特性的作用及意義。方法：取因創(chuàng)傷等原因致意外流產(chǎn)的妊娠24“26周齡胎兒背部皮膚標本，由南昌大學第一附屬醫(yī)院產(chǎn)科提供，均得到產(chǎn)婦或家屬知情同意，實驗經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。采用胰蛋白酶和乙二胺四乙酸聯(lián)合消化法分

4、離表皮、Ⅳ型膠原快速粘附法純化人表皮干細胞，以含表皮生長因子、角質(zhì)細胞無血清培養(yǎng)基組成的人表皮干細胞培養(yǎng)液進行體外培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡下觀察人表皮干細胞形態(tài)學變化，計算其克隆形成率，測定細胞周期，免疫細胞化學染色法行Dl整合素、’K19、p63和hTERT單抗檢測。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RTPCR)和蛋白質(zhì)免疫印跡法(Westemblot)分別檢測人表皮干細胞hTERTmRNA及其蛋白的表達，端粒重復(fù)序列擴增法(TRAP)ELISA檢測端