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文檔簡介
1、目的:惡性腫瘤是危害人類健康最嚴重的疾病之一。全世界每年約有700萬人死于腫瘤,我國的腫瘤死亡人數也在百萬以上。白血病是造血系統(tǒng)的惡性腫瘤,約占癌腫總發(fā)病率的5%左右。白血病的治療以化療為主,其作用是全身性的,毒副作用大。雖然有骨髓移植、免疫治療、基因治療等治療手段,但目前藥物性化療仍然是治療白血病最重要和最基本的方法?;熥畲蟮娜秉c是,化療藥物在殺傷腫瘤細胞的同時也殺傷正常的組織和細胞,引起嚴重致死性的并發(fā)癥。因此需要尋找新的更有針對
2、性、低毒高效的治療藥物?,F(xiàn)有觀點認為中西醫(yī)結合治療白血病的療效優(yōu)于單純化療。中草藥可減輕化療藥的毒副作用,提高機體免疫力,并可用于難治性急性白血?。ˋL)的挽救性治療。
細胞凋亡(apoptosis)是數十年來在生命科學領域引起廣泛興趣和關注的研究熱點。許多天然中草藥可以通過干擾腫瘤細胞生長、代謝、增殖等過程,最終誘導觸發(fā)腫瘤細胞發(fā)生凋亡。越來越多的資料表明無論是在殺傷腫瘤細胞或抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞分化、促進凋亡
3、,調整機體免疫功能,改善癥狀與體征,還是減輕放化療毒副作用或對腫瘤患者的調理,中草藥都發(fā)揮著重要作用。近半個世紀來人們越來越關注從傳統(tǒng)中草藥中提取有效成分用于臨床抗腫瘤治療。
穿心蓮內酯(Andrographolide,Andro)是從穿心蓮中提取純化得到的二萜內酯類單體化合物,在抗病毒、誘導細胞分化、抗腫瘤及免疫調節(jié)等方面均有活性。穿心蓮內酯的抗腫瘤作用機制主要表現(xiàn)為抑制腫瘤細胞增殖、阻滯腫瘤細胞周期進程并誘導細胞凋亡、
4、提高淋巴細胞抗腫瘤活性等方面。
本實驗主要觀察穿心蓮內酯對白血病細胞株U937和HL60的體外增殖抑制和誘導凋亡作用,并對其抗腫瘤作用機制進行初步探討,為穿心蓮內酯作為抗腫瘤藥物開發(fā)提供理論依據。
方法:
1.采用Cell Counting Kit-8試劑盒(CCK-8)檢測不同濃度穿心蓮內酯處理白血病細胞株U937和HL60細胞48小時后對U937和HL60細胞的增殖抑制作用,并求出IC50的
5、值。
2.對穿心蓮內酯處理過的白血病細胞株U937和HL60細胞以及對照組細胞,采用常規(guī)Giemsa染色和Hoechst33342熒光染色,光鏡下觀察穿心蓮內酯作用于細胞后,細胞凋亡的形態(tài)學變化。
3.采用流式細胞技術(flow cytometry,F(xiàn)CM)分別檢測不同濃度穿心蓮內酯(20、40、80μmol/L)作用于U937細胞和HL60細胞48小時后,細胞凋亡變化和細胞周期分布的改變。
4
6、.采用逆轉錄-聚合酶鏈反應(reverse transcription PCR,RT-PCR)半定量檢測不同濃度穿心蓮內酯(20、40、80μmol/L)作用48小時后,U937和HL60細胞內bcl-2、NF-κBmRNA的表達變化。
5.應用Caspase-Glo檢測試劑盒及比色法檢測穿心蓮內酯作用48小時時,誘導U937和HL60細胞凋亡過程中caspase-3/7活力的變化。
結果:
1
7、.穿心蓮內酯在1~100μmol/L濃度范圍內能明顯抑制白血病細胞U937細胞和HL60細胞體外增殖,抑制率呈明顯的濃度依賴性,與對照組比較各組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),其中100μmol/L穿心蓮內酯作用48小時后對U937細胞的抑制率最高,達到83.97%,穿心蓮內酯對HL60細胞增殖抑制作用不及U937細胞明顯,但作用48小時最高抑制率亦能達到71.64%。不同濃度穿心蓮內酯(1、10、100μmol/L)作用48小時U
8、937細胞和HL60細胞半數抑制濃度(IC50)分別為:21.86μmol/l,46.41μmol/l。在此實驗結果基礎上確定穿心蓮內酯的工作終濃度分別為20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L,在此濃度范圍內也存在明顯的劑量-效應關系,抑制率分別隨著藥物濃度增加而增加,與對照組相比具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
2.穿心蓮內酯作用后,U937和HL60細胞均出現(xiàn)典型的凋亡特征。普通光學顯微鏡下形態(tài)學表現(xiàn)為細
9、胞體積縮小、染色質聚集、核固縮、核碎裂等;熒光顯微鏡下表現(xiàn)為凋亡細胞顯示熒光標記,胞核濃集而呈亮藍色或核呈分葉,碎片狀,邊集。
3.流式細胞技術檢測結果顯示,穿心蓮內酯可誘導急性單核細胞性白血病細胞株U937細胞發(fā)生G0/G1期阻滯(由51.30%上升至94.10%),G2/M、S期細胞明顯減少;誘導急性粒細胞性白血病細胞株HL60細胞發(fā)生S期阻滯(由39.48%上升至67.93%),G0/G1、G2/M期細胞減少。同時兩
10、種白血病細胞株產生明顯的細胞凋亡.以80μmol/L穿心蓮內酯作用48h凋亡率最高,U937細胞達到52.48%,HL60細胞則為17.75%,凋亡不及U937細胞明顯。
4.半定量RT-PCR檢測結果顯示,經不同濃度穿心蓮內酯(20、40、80μmol/L)處理48h后,U937細胞中bcl-2 mRNA表達水平隨藥物作用濃度的增加而降低,與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),NF-κB mRNA的表達水平亦隨藥
11、物作用濃度的增加而降低,與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
5.用Caspase-Glo檢測試劑盒對caspase-3/7的活力測定實驗結果顯示,穿心蓮內酯處理組Caspase-3/7酶活性增加,與未加藥的對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
結論:穿心蓮內酯在一定濃度范圍內,能抑制白血病U937和HL60細胞增殖,具有明顯的劑量效應關系;其對U937細胞和HL60細胞的抑制作用可能與
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