大黃素對(duì)白血病細(xì)胞K562、U937的增殖抑制及機(jī)制初探.pdf

1、目的：白血?。↙eukemia）是一類造血干細(xì)胞的克隆性疾病，這些白血病細(xì)胞失去正常的成熟分化能力而停滯在細(xì)胞發(fā)育的某一階段，在骨髓和其他造血組織中白血病細(xì)胞大量增殖聚集，并浸潤(rùn)其他組織器官，使正常造血功能受到抑制。我國(guó)白血病的發(fā)病率約為2.76/10萬(wàn)。在惡性腫瘤所致的死亡率中，白血病居第6位（男性）和第8位（女性），但在兒童則居第一位。盡管不斷有新的化療藥物問世、并用于白血病的治療，造血干細(xì)胞移植技術(shù)也在不斷提高，但目前仍有許多白血

2、病患者不能取得完全緩解或在完全緩解后復(fù)發(fā)。原發(fā)或繼發(fā)耐藥及多藥耐藥的出現(xiàn)更增加了白血病治療的難度。因此，對(duì)于血液工作者而言，尋找新的有效治療白血病的藥物和有效的治療方案已經(jīng)成為一項(xiàng)長(zhǎng)期艱巨的任務(wù)。
　　 大黃素（Emodin，EM）是一種羥基蒽醌類化合物。它具有抗炎抑菌、免疫調(diào)節(jié)、抗胰酶、保護(hù)肝腎功能、抗腫瘤等生物活性，特別是大黃素的抗腫瘤作用，成為近年研究熱點(diǎn)。它通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、影響細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和影

3、響細(xì)胞周期、逆轉(zhuǎn)多藥耐藥等機(jī)制發(fā)揮其抗腫瘤作用。
　　 本文主要觀察不同濃度的大黃素對(duì)白血病細(xì)胞株K562、U937的增殖抑制作用，在細(xì)胞水平通過(guò)熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度大黃素對(duì)兩種細(xì)胞的形態(tài)學(xué)、細(xì)胞周期及凋亡率的影響，在分子水平上通過(guò)RT-PCR技術(shù)檢測(cè)不同濃度大黃素對(duì)兩種細(xì)胞內(nèi)bcl-2及NF-κB基因表達(dá)的影響，從而探討大黃素抑制白血病細(xì)胞株K562、U937增殖的有關(guān)機(jī)制。
　　 方法：
　　

4、1.細(xì)胞培養(yǎng)：將K562、U937細(xì)胞按常規(guī)用RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)液內(nèi)含10％新生牛血清（FBS）、100μg/mL青霉素、100U/mL鏈霉素和2mmol/L谷氨酰胺。置37℃，飽和度5％CO2環(huán)境下培養(yǎng)、傳代，每2-3天傳代一次。待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
　　 2.細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)：分別測(cè)定不同濃度大黃素對(duì)K562、U937細(xì)胞作用48小時(shí)的增殖抑制率。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞加入不同濃度的大黃素，培養(yǎng)48小時(shí)

5、后，加入CCK-8試劑。在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后，在450nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度。根據(jù)吸光度（A值）計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。抑制率（％）=（A對(duì)照組-A實(shí)驗(yàn)組）/A對(duì)照組×100％。
　　 3.熒光染色觀察細(xì)胞形態(tài)改變：分別收集IC50濃度的大黃素作用48h的K562、U937細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立不加大黃素的空白對(duì)照組。將細(xì)胞用PBS洗后重懸，加入Hochest33342熒光試劑染色。置熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)400個(gè)細(xì)胞，觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化

6、。
　　 4.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布及凋亡率：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562、U937細(xì)胞，加入不同濃度的大黃素作用于K562、U937細(xì)胞，48h后收集細(xì)胞，PBS洗后用70％乙醇4℃固定細(xì)胞，PBS再洗后加入RNA酶，10分鐘后用終濃度為50μg/ml的PI染色30 min。流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期，計(jì)算細(xì)胞周期變化及凋亡率。
　　 5.酶標(biāo)儀檢測(cè)caspase3/7活性：將K562、U937細(xì)胞接種于96孔板上。處理組的

7、培養(yǎng)液中加入大黃素，使大黃素終濃度為IC50濃度。在37℃、5％CO2體積分?jǐn)?shù)的條件下培養(yǎng)48h后，加入100μl caspase3/7試劑，4h后酶標(biāo)儀檢測(cè)各組細(xì)胞在405nm處的吸光度（A值）。
　　 6.RT-PCR檢測(cè)bcl-2、NF-κB的表達(dá)：Trizol法提取細(xì)胞總RNA，采用隨機(jī)引物法以M-MLV合成cDNA，以特異的引物擴(kuò)增目的基因，瓊脂糖凝膠電泳后Goldview染色，以β-action為內(nèi)參，分析mRNA相

8、對(duì)表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：
　　 1.大黃素能抑制K562、U937細(xì)胞生長(zhǎng)并具有濃度依賴性，對(duì)K562細(xì)胞的IC50為51.58μmol/L，對(duì)U937細(xì)胞的IC50為48.00μmol/L。
　　 2.大黃素處理后，熒光顯微鏡下出現(xiàn)熒光標(biāo)記的細(xì)胞增多，呈現(xiàn)亮藍(lán)色。
　　 3.流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果：大黃素處理后，K562細(xì)胞主要表現(xiàn)為S期細(xì)胞增多、G0/G1期及G2/M期細(xì)胞減少（P<0.05）；U937

9、細(xì)胞主要表現(xiàn)為G0/G1期細(xì)胞增多、G2/M期及S期細(xì)胞減少（P<0.05）。兩種細(xì)胞的凋亡率也隨濃度的增加而增加（P<0.05）。
　　 4.酶標(biāo)儀檢測(cè)caspase3/7活性：大黃素處理后K562、U937細(xì)胞內(nèi)的caspase3/7酶活性增加，與對(duì)照組相比有顯著性差異（P<0.05）。
　　 5.RT-PCR檢測(cè)bcl-2、NF-κ3的表達(dá)：大黃素處理后，K562、U937細(xì)胞內(nèi)的bcl-2、NF-κB的表達(dá)均較對(duì)