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文檔簡介
1、目的:白血?。↙eukemia)是一類造血干細(xì)胞的克隆性疾病,這些白血病細(xì)胞失去正常的成熟分化能力而停滯在細(xì)胞發(fā)育的某一階段,在骨髓和其他造血組織中白血病細(xì)胞大量增殖聚集,并浸潤其他組織器官,使正常造血功能受到抑制。我國白血病的發(fā)病率約為2.76/10萬。在惡性腫瘤所致的死亡率中,白血病居第6位(男性)和第8位(女性),但在兒童則居第一位。盡管不斷有新的化療藥物問世、并用于白血病的治療,造血干細(xì)胞移植技術(shù)也在不斷提高,但目前仍有許多白血
2、病患者不能取得完全緩解或在完全緩解后復(fù)發(fā)。原發(fā)或繼發(fā)耐藥及多藥耐藥的出現(xiàn)更增加了白血病治療的難度。因此,對于血液工作者而言,尋找新的有效治療白血病的藥物和有效的治療方案已經(jīng)成為一項(xiàng)長期艱巨的任務(wù)。
大黃素(Emodin,EM)是一種羥基蒽醌類化合物。它具有抗炎抑菌、免疫調(diào)節(jié)、抗胰酶、保護(hù)肝腎功能、抗腫瘤等生物活性,特別是大黃素的抗腫瘤作用,成為近年研究熱點(diǎn)。它通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、影響細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和影
3、響細(xì)胞周期、逆轉(zhuǎn)多藥耐藥等機(jī)制發(fā)揮其抗腫瘤作用。
本文主要觀察不同濃度的大黃素對白血病細(xì)胞株K562、U937的增殖抑制作用,在細(xì)胞水平通過熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測不同濃度大黃素對兩種細(xì)胞的形態(tài)學(xué)、細(xì)胞周期及凋亡率的影響,在分子水平上通過RT-PCR技術(shù)檢測不同濃度大黃素對兩種細(xì)胞內(nèi)bcl-2及NF-κB基因表達(dá)的影響,從而探討大黃素抑制白血病細(xì)胞株K562、U937增殖的有關(guān)機(jī)制。
方法:
4、1.細(xì)胞培養(yǎng):將K562、U937細(xì)胞按常規(guī)用RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng),培養(yǎng)液內(nèi)含10%新生牛血清(FBS)、100μg/mL青霉素、100U/mL鏈霉素和2mmol/L谷氨酰胺。置37℃,飽和度5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)、傳代,每2-3天傳代一次。待細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
2.細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn):分別測定不同濃度大黃素對K562、U937細(xì)胞作用48小時(shí)的增殖抑制率。取對數(shù)生長期的細(xì)胞加入不同濃度的大黃素,培養(yǎng)48小時(shí)
5、后,加入CCK-8試劑。在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后,在450nm波長下檢測吸光度。根據(jù)吸光度(A值)計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。抑制率(%)=(A對照組-A實(shí)驗(yàn)組)/A對照組×100%。
3.熒光染色觀察細(xì)胞形態(tài)改變:分別收集IC50濃度的大黃素作用48h的K562、U937細(xì)胞,同時(shí)設(shè)立不加大黃素的空白對照組。將細(xì)胞用PBS洗后重懸,加入Hochest33342熒光試劑染色。置熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)400個(gè)細(xì)胞,觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化
6、。
4.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布及凋亡率:取對數(shù)生長期的K562、U937細(xì)胞,加入不同濃度的大黃素作用于K562、U937細(xì)胞,48h后收集細(xì)胞,PBS洗后用70%乙醇4℃固定細(xì)胞,PBS再洗后加入RNA酶,10分鐘后用終濃度為50μg/ml的PI染色30 min。流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期,計(jì)算細(xì)胞周期變化及凋亡率。
5.酶標(biāo)儀檢測caspase3/7活性:將K562、U937細(xì)胞接種于96孔板上。處理組的
7、培養(yǎng)液中加入大黃素,使大黃素終濃度為IC50濃度。在37℃、5%CO2體積分?jǐn)?shù)的條件下培養(yǎng)48h后,加入100μl caspase3/7試劑,4h后酶標(biāo)儀檢測各組細(xì)胞在405nm處的吸光度(A值)。
6.RT-PCR檢測bcl-2、NF-κB的表達(dá):Trizol法提取細(xì)胞總RNA,采用隨機(jī)引物法以M-MLV合成cDNA,以特異的引物擴(kuò)增目的基因,瓊脂糖凝膠電泳后Goldview染色,以β-action為內(nèi)參,分析mRNA相
8、對表達(dá)水平。
結(jié)果:
1.大黃素能抑制K562、U937細(xì)胞生長并具有濃度依賴性,對K562細(xì)胞的IC50為51.58μmol/L,對U937細(xì)胞的IC50為48.00μmol/L。
2.大黃素處理后,熒光顯微鏡下出現(xiàn)熒光標(biāo)記的細(xì)胞增多,呈現(xiàn)亮藍(lán)色。
3.流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果:大黃素處理后,K562細(xì)胞主要表現(xiàn)為S期細(xì)胞增多、G0/G1期及G2/M期細(xì)胞減少(P<0.05);U937
9、細(xì)胞主要表現(xiàn)為G0/G1期細(xì)胞增多、G2/M期及S期細(xì)胞減少(P<0.05)。兩種細(xì)胞的凋亡率也隨濃度的增加而增加(P<0.05)。
4.酶標(biāo)儀檢測caspase3/7活性:大黃素處理后K562、U937細(xì)胞內(nèi)的caspase3/7酶活性增加,與對照組相比有顯著性差異(P<0.05)。
5.RT-PCR檢測bcl-2、NF-κ3的表達(dá):大黃素處理后,K562、U937細(xì)胞內(nèi)的bcl-2、NF-κB的表達(dá)均較對
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