永久性缺血腦損傷致血腦屏障緊密連接蛋白損害機制研究.pdf

1、背景:
　　 腦卒中(Stroke)是一種由各種誘發(fā)因素引起腦內(nèi)動脈狹窄、閉塞或破裂而造成的腦血液循環(huán)障礙性疾病,在我國腦卒中已成為我國第一大致殘和第二大致死疾病。腦卒中機制復雜比較復雜,實驗模型有局限性,加上以往研發(fā)新藥的腦保護作用過于單一,導致迄今沒有療效確切的新藥用于臨床。近年來,隨著臨床上缺血性腦卒中發(fā)病率的增加,迫切需要對其發(fā)病機制進行深入研究。
　　 近年來專家指出腦血管保護應該予以足夠重視,提出了神經(jīng)血管單

2、元(NeurovascularUnit,NVU)[3-13]概念,強調(diào)從整體上研究神經(jīng)血管單元組分損傷和保護機制。神經(jīng)血管單元維持著神經(jīng)元的正常生理功能以及受損神經(jīng)元的修復。血腦屏障[14-21]包括血管內(nèi)皮細胞、星形膠質(zhì)細胞、周細胞、胞外間隙及基底膜。血腦屏障作為神經(jīng)血管單元的重要部分,它的損害直接影響神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定,是缺血性腦卒中發(fā)生發(fā)展中的重要病理現(xiàn)象。雖然近些年關于血腦屏障損害機制研究很多,眾多水解酶參與血腦屏障損傷,但是

3、復雜的機制及各個機制之間的Cross-Talk還不清楚。
　　 目的:
　　 通過構(gòu)建缺糖缺氧(Oxygen-GlucoseDeprivation,OGD)內(nèi)皮細胞損傷模型及永久性大腦中動脈缺血(PermanentMiddleCerebralArteryOcclusion,p-MCAO)腦損傷模型模擬體內(nèi)外血腦屏障(Blood-BrainBarrier,BBB)損害,探索血腦屏障損害病理狀態(tài)下緊密連接蛋白的變化,并通過藥

4、物調(diào)控深入探索BBB損傷機制,以期為缺血性腦卒中的臨床治療藥物的研發(fā)提供實驗依據(jù)。
　　 方法:
　　 整體動物水平:
　　 1.健康成年SD大鼠40只,雄性,8周齡,麻醉后固定手術板上,用腦血流測定儀測定缺血前腦血流,然后線栓法制作永久性大腦中動脈缺血模型。
　　 (1)實驗大鼠永久性大腦中動脈缺血后腦血流測定。選擇0h,1h,12h,24h時間點測定缺血后腦血流的改變。
　　 (2)采用Eva

5、nsBlue法檢測永久性腦缺血后BBB損害情況。22h時尾靜脈注射2％伊文氏藍溶液(EvansBlue,EB),24h時麻醉,左心室灌流,然后斷頭取腦,拍照,收集樣本,凍存于-80℃,最后進行EB含量測定[24]。
　　 (3)免疫印跡法研究BBB損害關聯(lián)蛋白變化規(guī)律。選擇0h,1h,2h,6h,12h,24h時間點斷頭取腦,放于0.32mol/LSucrose溶液中浸泡5min,然后用腦切片模具切片并收集腦組織時效樣本,凍存于

6、-80℃用于后續(xù)研究。
　　 2.健康成年SD大鼠40只,雄性,8周齡,隨機分為Vehicle組、鈣調(diào)蛋白酶抑制劑組(ALLM組)、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑組(Batimastat組)和γ-分泌酶抑制劑組(DAPT組),每組10只。大鼠側(cè)腦室給藥(Vehicle組腦室注射人工腦脊液),給藥半小時后用線栓制作永久性大腦中動脈缺血模型,24h后斷頭取腦,收集樣本。Western-blot及熒光免疫組化方法考察BBB相關蛋白表達的變化,探

7、索BBB損傷機制。
　　 細胞水平:
　　 1.取生長良好、狀態(tài)一致的EA.hy926內(nèi)皮細胞,隨機分為5組(Con組,OGD組,ALLM組,DAPT組,Batimastat組)。提前兩小時向內(nèi)皮細胞中對應加入蛋白水解酶抑制劑ALLM、DAPT和Batimastat,Con組細胞正常培養(yǎng),OGD組給予二甲亞砜(DimethylSulfoxide,DMSO),然后將OGD組和給藥組進行OGD造模12h。收集樣本,Weste

8、rn-blot法檢測相關蛋白表達。
　　 2.取生長良好、狀態(tài)一致的EA.hy926內(nèi)皮細胞,隨機分為4組(Con組,DAPT組,OGD12h組,DAPT+OGD12h組)。提前兩小時向內(nèi)皮細胞中對應加入蛋白水解酶抑制劑DAPT,Con組細胞正常培養(yǎng),OGD12h組給予DMSO,然后將OGD12h組和DAPT+OGD12h組細胞放入密閉罐中OGD造模12h。收集樣本,Western-blot法檢測相關蛋白表達。激光共聚焦免疫熒光

9、染色法觀察緊密連接蛋白表達變化。
　　 結(jié)果:
　　 整體動物水平上,永久性大腦中動脈缺血后出現(xiàn)嚴重神經(jīng)血管單元受損(神經(jīng)血管單元損傷標記物Spectrin和Calcineurin出現(xiàn)活性裂解片段);受試動物血腦屏障相關的緊密連接蛋白出現(xiàn)低分子量裂解片段,同時觀察到zonaoccludens-1(ZO-1)蛋白和Occludin蛋白由胞膜向胞漿移位;在永久性缺血受試動物上觀察到Calpastatin及Notch蛋白表達量

10、有明顯減少,而DAPT藥物調(diào)控后可以使緊密連接蛋白裂解片段減少,部分逆轉(zhuǎn)Calpastatin、Notch-1及Notch胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(Notchintracellulardomam,NICD)蛋白的下調(diào);內(nèi)皮細胞OGD6h造模后,免疫熒光細胞化學染色法即可以觀察到緊密連接蛋白出現(xiàn)再分布變化,提示緊密連接蛋白早期即發(fā)生損傷,Western-blot結(jié)果顯示DAPT調(diào)控后可以部分逆轉(zhuǎn)Calpastatin、Notch-1及NICD的下調(diào)。<