緊密連接蛋白Claudin-1與大腸癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)性的研究.pdf

1、背景與目的 大腸癌(Colorectal adenocarcinoma，CRC)發(fā)病率和死亡率居全球惡性腫瘤第三位和第四位。在發(fā)達(dá)國家發(fā)病率居惡性腫瘤第二位，為5％。當(dāng)病變還局限在腸壁時(shí)外科手術(shù)是治療的基礎(chǔ)，70％-80％的病人通過病灶的切除得以治愈。外科治療后，病灶局限的病人5年生存率為90％，而假如有了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移5年生存率則減為65％，因此對大腸癌的早期檢測是提高生存率最有效的辦法。 現(xiàn)在多認(rèn)為大腸癌由正常粘膜轉(zhuǎn)化為

2、癌前病變腺瘤然后成為大腸癌是由一系列基因改變而引起。在腫瘤研究中，生物標(biāo)志物可提示體內(nèi)癌癥的存在。大多數(shù)生物標(biāo)志物基于基因突變或RNA、蛋白和代謝產(chǎn)物的異常改變，因此可用于檢測早期大腸癌，以及預(yù)測疾病預(yù)后、監(jiān)控疾病過程和對治療的反應(yīng)。 近年發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的膜蛋白Claudins家族。Claudins屬于四分子交聯(lián)體，為緊密連接蛋白，至少包括了24個(gè)家庭成員，位于腺上皮和內(nèi)皮細(xì)胞膜靠腔面的一端，是相鄰細(xì)胞膜之間最頂端的接觸，對上皮細(xì)

3、胞的屏障功能起著重要作用。它們編碼4個(gè)跨膜區(qū)，N和C羧基末端均在細(xì)胞漿內(nèi)。在正常上皮，緊密連接的主要功能是封閉腺上皮頂端的間隙，形成一個(gè)能阻止大分子物質(zhì)通過細(xì)胞膜之間的間隙進(jìn)入基底外側(cè)區(qū)域的屏障。緊密連接是主導(dǎo)細(xì)胞粘附、細(xì)胞極性和腺體分化的關(guān)鍵因素之一。由于它可作為胞外環(huán)境到胞內(nèi)信號通道的結(jié)合點(diǎn)，因此在細(xì)胞增生、腫瘤形成、細(xì)胞骨架等方面扮演了重要角色，越來越多的研究表明，這個(gè)家族許多成員對惡性腫瘤轉(zhuǎn)移有著重要影響。Claudins家族中

4、不同成員在不同器官癌癥的作用并不是非常清楚。腫瘤細(xì)胞特別是那些高轉(zhuǎn)移潛能的癌細(xì)胞通常表現(xiàn)為Claudins表達(dá)下降，但亦有報(bào)道某些Claudins成員在一些腫瘤中是增加的，如Claudin-1(CLD1)在大腸癌是增加的。 有報(bào)導(dǎo)CLD1可以促進(jìn)癌細(xì)胞pro-MMP-2的活性，這表明它是癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移潛在因素。還有報(bào)導(dǎo)CLDl可能是β-catenin/Tcf信號通路的靶基因，這支持CLD1可能是調(diào)控結(jié)腸癌潛在基因。綜上所述，我們

5、推測CLD1參與了大腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過程，是大腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的潛在因素。 大腸癌的組織分期是一個(gè)重要預(yù)后指標(biāo)，由于目前國際上尚無按組織分期對CLD1進(jìn)行系統(tǒng)研究的報(bào)道，此范圍的研究仍屬空白，因此我們應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測大腸正常．腺瘤．癌(不同Dukes分期)組織中CLD1的表達(dá)，以利于明確其與大腸癌變病程的關(guān)系。 然后我們選取三株已證實(shí)具在不同轉(zhuǎn)移潛能的大腸癌細(xì)胞株SW620，SW480和SW1116為研究對象，通

6、過激光共聚焦顯微鏡、實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(FQ RT-PCR)和Western Blot檢測CLD1在這三株細(xì)胞的表達(dá)，隨后進(jìn)行CLD1基因轉(zhuǎn)染和RNA干擾，對基因進(jìn)行調(diào)控，觀測調(diào)控前后大腸癌細(xì)胞在體外和動物體內(nèi)侵襲轉(zhuǎn)移生物學(xué)行為變化，初步探研CLD1影響大腸癌侵襲轉(zhuǎn)移行為的機(jī)制。由于CLD1是膜蛋白，位于細(xì)胞表面，研究CLD1表達(dá)與調(diào)控將有助于闡明腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制，并可能為大腸癌的診治帶來新的研究靶點(diǎn)。 結(jié)論

7、 1．免疫組織化學(xué)方法檢測CLD1在大腸組織中的表達(dá)，CLD1主要位于腸上皮細(xì)胞，而在細(xì)胞外基質(zhì)基本不表達(dá)。大部分正常粘膜與息肉局限在細(xì)胞膜表達(dá)，少有漿表達(dá)，且僅為弱陽性。腺瘤漿表達(dá)百分比增多、強(qiáng)度增加，大腸癌A期增強(qiáng)最顯著。從腺瘤開始總陽性表達(dá)百分比顯著增高，A期強(qiáng)陽性最多。說明CLD1表達(dá)改變可能提示早期大腸癌發(fā)生。 2．運(yùn)用免疫細(xì)胞化學(xué)和激光共聚焦顯微鏡檢測三株不同轉(zhuǎn)移潛能的大腸癌細(xì)胞株Sw1116、SW480和S

8、W620在CLD1表達(dá)部位，發(fā)現(xiàn)CLD1在細(xì)胞中的表達(dá)部位隨著大腸癌的轉(zhuǎn)移潛能增強(qiáng)由細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移至細(xì)胞漿和細(xì)胞核。FQ RT-PCR從mRNA水平、免疫蛋白印記從蛋白表達(dá)水平檢測顯示CLD1表達(dá)在SW1116，SW480，SW620細(xì)胞株之間存在差異，SW1116

9、胞與基質(zhì)的粘附力；增加細(xì)胞的侵襲能力；增加細(xì)胞的遷移能力。 4．構(gòu)建的CLD1發(fā)夾siRNA真核表達(dá)載體可有效抑制SW620 CLD1的表達(dá)量，在體外增加細(xì)胞之間粘附，抑制與基底膜的粘附，降低細(xì)胞的侵襲能力和遷移能力。動物實(shí)驗(yàn)說明降低CLD1表達(dá)可降低裸鼠成瘤能力，降低淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和血行轉(zhuǎn)移能力，說明CLD1正向調(diào)控大腸癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。 5．CLD1可能在大腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用，有望成為大腸癌病人診斷