緊密連接蛋白Claudin-1與大腸癌侵襲轉移相關性的研究.pdf

1、背景與目的 大腸癌(Colorectal adenocarcinoma，CRC)發(fā)病率和死亡率居全球惡性腫瘤第三位和第四位。在發(fā)達國家發(fā)病率居惡性腫瘤第二位，為5％。當病變還局限在腸壁時外科手術是治療的基礎，70％-80％的病人通過病灶的切除得以治愈。外科治療后，病灶局限的病人5年生存率為90％，而假如有了淋巴結轉移5年生存率則減為65％，因此對大腸癌的早期檢測是提高生存率最有效的辦法。 現(xiàn)在多認為大腸癌由正常粘膜轉化為

2、癌前病變腺瘤然后成為大腸癌是由一系列基因改變而引起。在腫瘤研究中，生物標志物可提示體內癌癥的存在。大多數(shù)生物標志物基于基因突變或RNA、蛋白和代謝產物的異常改變，因此可用于檢測早期大腸癌，以及預測疾病預后、監(jiān)控疾病過程和對治療的反應。 近年發(fā)現(xiàn)了一個新的膜蛋白Claudins家族。Claudins屬于四分子交聯(lián)體，為緊密連接蛋白，至少包括了24個家庭成員，位于腺上皮和內皮細胞膜靠腔面的一端，是相鄰細胞膜之間最頂端的接觸，對上皮細

3、胞的屏障功能起著重要作用。它們編碼4個跨膜區(qū)，N和C羧基末端均在細胞漿內。在正常上皮，緊密連接的主要功能是封閉腺上皮頂端的間隙，形成一個能阻止大分子物質通過細胞膜之間的間隙進入基底外側區(qū)域的屏障。緊密連接是主導細胞粘附、細胞極性和腺體分化的關鍵因素之一。由于它可作為胞外環(huán)境到胞內信號通道的結合點，因此在細胞增生、腫瘤形成、細胞骨架等方面扮演了重要角色，越來越多的研究表明，這個家族許多成員對惡性腫瘤轉移有著重要影響。Claudins家族中

4、不同成員在不同器官癌癥的作用并不是非常清楚。腫瘤細胞特別是那些高轉移潛能的癌細胞通常表現(xiàn)為Claudins表達下降，但亦有報道某些Claudins成員在一些腫瘤中是增加的，如Claudin-1(CLD1)在大腸癌是增加的。 有報導CLD1可以促進癌細胞pro-MMP-2的活性，這表明它是癌細胞侵襲轉移潛在因素。還有報導CLDl可能是β-catenin/Tcf信號通路的靶基因，這支持CLD1可能是調控結腸癌潛在基因。綜上所述，我們

5、推測CLD1參與了大腸癌細胞侵襲轉移過程，是大腸癌細胞侵襲轉移的潛在因素。 大腸癌的組織分期是一個重要預后指標，由于目前國際上尚無按組織分期對CLD1進行系統(tǒng)研究的報道，此范圍的研究仍屬空白，因此我們應用免疫組織化學方法檢測大腸正常．腺瘤．癌(不同Dukes分期)組織中CLD1的表達，以利于明確其與大腸癌變病程的關系。 然后我們選取三株已證實具在不同轉移潛能的大腸癌細胞株SW620，SW480和SW1116為研究對象，通

6、過激光共聚焦顯微鏡、實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈式反應(FQ RT-PCR)和Western Blot檢測CLD1在這三株細胞的表達，隨后進行CLD1基因轉染和RNA干擾，對基因進行調控，觀測調控前后大腸癌細胞在體外和動物體內侵襲轉移生物學行為變化，初步探研CLD1影響大腸癌侵襲轉移行為的機制。由于CLD1是膜蛋白，位于細胞表面，研究CLD1表達與調控將有助于闡明腫瘤細胞的侵襲轉移機制，并可能為大腸癌的診治帶來新的研究靶點。 結論

7、 1．免疫組織化學方法檢測CLD1在大腸組織中的表達，CLD1主要位于腸上皮細胞，而在細胞外基質基本不表達。大部分正常粘膜與息肉局限在細胞膜表達，少有漿表達，且僅為弱陽性。腺瘤漿表達百分比增多、強度增加，大腸癌A期增強最顯著。從腺瘤開始總陽性表達百分比顯著增高，A期強陽性最多。說明CLD1表達改變可能提示早期大腸癌發(fā)生。 2．運用免疫細胞化學和激光共聚焦顯微鏡檢測三株不同轉移潛能的大腸癌細胞株Sw1116、SW480和S

8、W620在CLD1表達部位，發(fā)現(xiàn)CLD1在細胞中的表達部位隨著大腸癌的轉移潛能增強由細胞膜轉移至細胞漿和細胞核。FQ RT-PCR從mRNA水平、免疫蛋白印記從蛋白表達水平檢測顯示CLD1表達在SW1116，SW480，SW620細胞株之間存在差異，SW1116

9、胞與基質的粘附力；增加細胞的侵襲能力；增加細胞的遷移能力。 4．構建的CLD1發(fā)夾siRNA真核表達載體可有效抑制SW620 CLD1的表達量，在體外增加細胞之間粘附，抑制與基底膜的粘附，降低細胞的侵襲能力和遷移能力。動物實驗說明降低CLD1表達可降低裸鼠成瘤能力，降低淋巴結轉移和血行轉移能力，說明CLD1正向調控大腸癌細胞的侵襲轉移能力。 5．CLD1可能在大腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用，有望成為大腸癌病人診斷