缺氧-復(fù)氧損傷對體外腸粘膜Caco-2細胞緊密連接蛋白的影響.pdf

1、目的：
　　2004年世界上大約有500萬死于創(chuàng)傷。2008年，年齡在1歲至19歲的兒童第一大死亡原因是意外傷害。預(yù)計到2020年，來自世界各地的傷害死亡人數(shù)預(yù)計將增加至800萬。其中，失血性休克造成的死亡占三分之一。創(chuàng)傷/失血性休克(T/HS)引發(fā)內(nèi)臟血液循環(huán)減少，其后的復(fù)蘇可造成組織、臟器的缺血/再灌注(I/R)損傷，引發(fā)氧應(yīng)激反應(yīng)，自由基以及毒性細胞因子過度生成，進一步損害器官。腸黏膜上皮細胞損傷可導(dǎo)致黏膜屏障破壞，通透性增

2、加，細菌移位，細菌內(nèi)毒素(LPS)通過腸道粘膜上皮，進入腸系膜淋巴結(jié)、肝臟、脾臟、肺臟和血液循環(huán)，而引發(fā)過度的炎癥反應(yīng)，炎癥介質(zhì)釋放（如TNF、IL等），觸發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS），甚至引起多器官功能障礙綜合征(MODS)。如何預(yù)防和阻止臟器缺血/再灌注(I/R)損傷，尤其是腸道I/R損傷，是臨床治療重度創(chuàng)傷/失血性休克(T/HS)、感染性休克、胸腹主動脈瘤手術(shù)和器官移植中減少和降低系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)和多器官功能不

3、全綜合征(MODS)的重要課題。細胞間的緊密連接(TJ)是腸黏膜屏障主要的連接方式。其主要有Occludin（咬合蛋白）、Claudin、Zona Occludens(ZOs)等。本實驗培養(yǎng)人類大腸粘膜上皮細胞Caco-2細胞，模擬體外缺氧/復(fù)氧模型，并檢測其緊密連接蛋白Occludin、Claudin-1、ZO-1的變化，試圖為治療缺血/再灌注損傷提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　在六孔細胞培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)單層人類大腸粘膜上皮細

4、胞Caco-2，應(yīng)用AAPH(2，2'-偶氮二(2-脒基丙烷)二鹽酸鹽）誘導(dǎo)離體腸粘膜上皮細胞缺氧/復(fù)氧損傷，承有單層Caco-2細胞的嵌套膜系（培養(yǎng)孔）統(tǒng)隨機分為兩組:對照組、實驗組。對照組不處理，實驗組進行缺氧處理后在進行復(fù)氧。HE染色檢測TJ結(jié)構(gòu)通透性變化的指標(biāo)。應(yīng)用免疫熒光、電鏡觀察Occludin, ZO-1，Claudin-1幾何分布的變化;酚紅透過率檢測腸道粘膜上皮細胞間緊密連接的開放程度。
　　結(jié)果：
　　H

5、E染色和免疫熒光下對照組細胞Occludin，ZO-1，Claudin-1免疫熒光染色顯示整齊和連續(xù)，在細胞邊界有規(guī)律的分布，缺氧/復(fù)氧組免疫熒光區(qū)域顯示明顯減弱，整個單層細胞散在缺損，在細胞邊界染色的緊密連接蛋白變模糊，蛋白定位出現(xiàn)彌散和不連續(xù)，單層細胞染色整體實質(zhì)性減少，彌散染色減少;電鏡下缺氧/復(fù)氧緊密連接開放，通透性明顯增加，而對照組緊密連接處于關(guān)閉狀態(tài);酚紅透過率檢測顯示:和對照組比較，實驗組緊密連接開放明顯增加，且統(tǒng)計學(xué)差異