HMGN2分子的分離純化及其抗乙型肝炎病毒活性研究.pdf

1、高遷移率組蛋白N2(Higj Mobility Group Chromosal protein N2，HMGN2)是脊椎動(dòng)物和非脊椎動(dòng)物的細(xì)胞核中普遍存在的非組蛋白，目前對(duì)其功能還不完全清楚。在本實(shí)驗(yàn)室從人LAK細(xì)胞和人宮頸黏液中分離純化尋找抗菌肽過程中，發(fā)現(xiàn)HMGN2具有較強(qiáng)的抗革蘭氏陰性菌的作用，為進(jìn)一步深入研究HMGN2的生物學(xué)新功能，本文重點(diǎn)研究其體外抗乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)的功能。

2、目的:1.從人單核細(xì)胞株THP-1中分離與純化HMGN2，探討HMGN2分子的抗菌作用。2．應(yīng)用HepG2．2.15細(xì)胞株作為體外抗乙型肝炎病毒的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停瑢?duì)HMGN2分子是否抑制乙肝病毒表面抗原(HBsAg)、e抗原(HBeAg)和HBV DNA的分泌、抑制程度作初步探討，為尋求新的抗HBV藥物開辟途徑。 方法:大量培養(yǎng)人單核細(xì)胞株THP-1細(xì)胞，收集THP-1細(xì)胞沉淀，加入適量5％乙酸，在冰浴中電動(dòng)勻漿，收集上清液，經(jīng)透析除

3、去乙酸、冷凍干燥得到THP-1細(xì)胞的酸溶性提取物。酸溶性提取物經(jīng)RP-HPLC分離，用瓊脂糖彌散抗菌法篩選純化組分的抗菌活性，對(duì)活性組分進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE電泳，AU-PAGE電泳分析，得到純化的HMGN2。以HBV DNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株HepG2.2.15細(xì)胞為模型，HMGN2作用后檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中的HBsAg、HBeAg和HBV DNA，對(duì)HMGN2抗HBV效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。在HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)基中分別加入不同濃

4、度的HMGN2蛋白，培養(yǎng)的第4天、第8天收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定技術(shù)(ELISA)檢測(cè)上清液中：HBsAg和HBeAg含量，用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HBV DNA的變化。 結(jié)果:THP-1細(xì)胞的酸溶性粗提物通過HPLC分離，在第21分鐘出峰時(shí)間(保留時(shí)間)純化出一個(gè)分子(即HMGN2)，該分子對(duì)大腸桿菌氨芐青霉素耐藥株ML-35p有較強(qiáng)的抑菌活性。瓊脂糖彌散法檢測(cè)顯示HMGN2對(duì)大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株ATC

5、C25922和臨床分離株54080有較強(qiáng)的抗菌活性，而對(duì)金黃色葡萄球菌ATCC25923及綠膿桿菌ATCC27853未檢測(cè)到抗菌活性。HMGN2在本實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)有抑制HBV增殖作用，表現(xiàn)為培養(yǎng)上清中HBsAg、HBeAg分泌減少，以及細(xì)胞上清液中HBV DNA水平降低，HMGN2抑制HBV以無血清條件下效果更明顯，濃度為2μg/ml抗病毒效果達(dá)最大，可使HBV DNA拷貝數(shù)減少95.4％，繼續(xù)增加劑量抗病毒效果不再增加。與人中性粒細(xì)胞