組織蛋白酶S在糖尿病大鼠早期動(dòng)脈粥樣硬化中的表達(dá)及意義.pdf

1、目的：糖尿病大血管病變是2型糖尿病最常見(jiàn)的慢性并發(fā)癥之一，是糖尿病患者致死致殘的主要原因。動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是糖尿病大血管病變基本的病理改變，以炎癥、內(nèi)皮損傷和平滑肌細(xì)胞增生、遷移為早期主要特征。組織蛋白酶S(Cathepsin S，Cat S)是一種蛋白水解酶，近年來(lái)有研究表明它是AS形成過(guò)程中降解細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular membrane，ECM)的主要蛋白酶，對(duì)AS的形成和發(fā)展起到重

2、要作用。本研究通過(guò)觀察糖尿病模型大鼠主動(dòng)脈Cat S表達(dá)，以及α-硫辛酸對(duì)其表達(dá)的作用和對(duì)大鼠氧化應(yīng)激狀態(tài)的影響，進(jìn)一步認(rèn)識(shí)糖尿病AS的發(fā)病機(jī)制，探索糖尿病AS早期防治的途徑。 方法： (1)21只SD雄性大鼠隨機(jī)分為正常組9只和鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)糖尿病模型組12只，4周后取其主動(dòng)脈，HE染色，光鏡下觀察其形態(tài)，并用基因芯片技術(shù)分析Cat S mRNA的表達(dá)。 (2)健康雄性Wistar大鼠(對(duì)照組)和自發(fā)

3、性糖尿病模型大鼠(Goto-Kakisaki，GK)(糖尿病組)各5只，均喂養(yǎng)高脂飼料，12周后麻醉大鼠，取主動(dòng)脈下段2～3cm主動(dòng)脈，置于10％中性福爾馬林液中固定，常規(guī)石蠟包埋后切片(2.5 μm)，進(jìn)行HE染色，采用免疫組化方法觀察Cat S、Mac、SMC、RECA、NFrB及iNOS的表達(dá)。 (3)健康雄性Wistar大鼠5只作為正常對(duì)照組，自發(fā)性糖尿病模型大鼠(GK)隨機(jī)分為糖尿病對(duì)照組5只和硫辛酸治療組6只，均予高

4、脂飲食，治療組隔日1次腹腔注射α-硫辛酸35mg/KgBw，其它2組注射等劑量生理鹽水，12周后麻醉大鼠，立即分離主動(dòng)脈，剝離外膜，取約lmm3動(dòng)脈組織置于戊二醛中沖洗，固定，利用透射電鏡技術(shù)進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察。其余動(dòng)脈組織PBS沖洗管腔，放入凍存管中投入液氮保存，然后進(jìn)行總RNA提取及熒光定量逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)(SYBR Green quantitmive reverse transcription polymerase chain

5、reaction，SYBRGreen RT-PCR)來(lái)觀察Cat S及NADPH氧化酶亞基p47 phox的表達(dá)，同時(shí)測(cè)定血清MDA、SOD、GSH水平。 結(jié)果： (1)STZ 誘導(dǎo)的糖尿病人鼠4周時(shí)主動(dòng)脈組織形態(tài)學(xué)上未見(jiàn)到明顯的改變，但Cat S基因表達(dá)較對(duì)照組明顯上調(diào)。 (2)12周光鏡下對(duì)照組和糖尿病組大鼠(GK)動(dòng)脈壁皆無(wú)明顯動(dòng)脈粥樣硬化改變，糖尿病組大鼠可見(jiàn)細(xì)胞外基質(zhì)增多，內(nèi)皮不連續(xù)等異常改變。免疫組化

6、染色提示對(duì)照組和糖尿病組大鼠均無(wú)Cat S和Mac表達(dá)；SMC actin染色可見(jiàn)中膜及內(nèi)膜層SMC排列規(guī)則，內(nèi)膜SMC未見(jiàn)增生；糖尿病組大鼠RECA染色可見(jiàn)內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)缺損，排列不連續(xù)，內(nèi)膜下未見(jiàn)染色，糖尿病組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮NF-KB和iNOS表達(dá)明顯較對(duì)照組增強(qiáng)。 (3)熒光定量RT-PCR.測(cè)定顯示，Cat S mRNA水平在糖尿病對(duì)照組表達(dá)較正常對(duì)照組升高(P=-0.001)，在α-硫辛酸治療組Cat S mRNA水平與

7、糖尿病組相比降低但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.071)。糖尿病對(duì)照組大鼠p47phox表達(dá)與正常對(duì)照組相比稍增高(P=0.862)，α-硫辛酸治療組p47phox表達(dá)較糖尿病對(duì)照組及正常對(duì)照組均降低(P=0.164，P=0.155)，三組表達(dá)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。透射電鏡見(jiàn)三組大鼠皆無(wú)明顯超微結(jié)構(gòu)改變。12周糖尿病組大鼠血清MDA水平明顯高于，SOD和GSH水平明顯低于正常對(duì)照組，而硫辛酸治療后血清MDA水平明顯低于糖尿病對(duì)照組，SOD和GSH水平

8、明顯高于糖尿病對(duì)照組。 結(jié)論： 短期高糖導(dǎo)致各種基因的異常表達(dá)先于組織形態(tài)學(xué)變化，其中Cat S基因表現(xiàn)為異常增高。在進(jìn)一步對(duì)GK大鼠的研究中，長(zhǎng)期喂養(yǎng)高脂飲食無(wú)明顯動(dòng)脈粥樣硬化形成的情況下，Cat S mRNA水平在正常組及糖尿病組之間已經(jīng)有所差別，糖尿病組表達(dá)較對(duì)照組升高，但其蛋白水平在動(dòng)脈壁中表達(dá)兩組皆呈陰性，可能由于其表達(dá)量較低，免疫組化方法靈敏度不夠?qū)е?。這似乎提示，Cat S可能并不是動(dòng)脈粥樣硬化病變形成的主