殼聚糖-基因疫苗納米顆粒的制備與作用研究.pdf

1、基因治療和基因免疫是將表達目的蛋白的基因構件直接注入動物體內(nèi)進行疾病治療和免疫預防的一種方法，對遺傳性疾病、腫瘤和復雜傳染病的預防和治療具有獨特的優(yōu)點。而基因遞送載體的構建和改進，一直是基因治療和基因免疫研究的重點。在臨床應用上，目前廣泛使用的病毒載體所存在的潛在性安全性問題不斷引起人們的擔憂，因此非病毒性載體的基因轉移運載體系的研發(fā)開始成為新的研究熱點。 殼聚糖是天然的陽離子多糖，作為基因轉移的非病毒型載體時，可以與帶負電荷的

2、質(zhì)粒DNA相結合，對DNA有很好的結合和保護作用，并使其可吸附于表面帶負電荷的細胞，從而利于所包裹的質(zhì)粒DNA轉染入吸附的細胞。殼聚糖在體內(nèi)可被機體消化吸收，具有生物可降解性、生物相容性和低毒性等良好的生物學特性，是自然界中不可多得的天然高分子載體材料。 本實驗針對殼聚糖在對質(zhì)粒疫苗的包裹特性，使用硫酸鈉鹽誘導的復凝聚法制備出殼聚糖/質(zhì)粒DNA納米顆粒，通過透射電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)所制備的顆粒近似球形，大小均一，直徑為40-80nm。

3、對所制備的殼聚糖納米顆粒進行了對質(zhì)粒DNA的包封率、體外釋放情況、對所包裹的質(zhì)粒DNA的DNaseI的酶保護性以及顆粒的穩(wěn)定性等理化特性方面的初步的研究，結果顯示殼聚糖納米顆粒對質(zhì)粒DNA的包裹率接近100％，可抵抗DNaseI的降解，殼聚糖納米顆在體外的自身釋放緩慢，即穩(wěn)定性高，可在-20℃長期保存，對保存條件要求不高。 本研究應用含不同報告基因的質(zhì)粒DNA，經(jīng)殼聚糖包裹成納米顆粒后注射小鼠，分別針對體內(nèi)表達和基因免疫水平進行

4、初步研究，對殼聚糖納米顆粒介導的基因表達和基因免疫進行了研究，同時用人工合成的陽離子多聚物乙酰亞胺(PEI)基因遞送載體作為比較。將包裹了含增強型綠色熒光蛋白基因的pEGFP-N1質(zhì)粒的殼聚糖納米顆粒溶液轉染HEK293T細胞，轉染后可觀察到發(fā)出綠色熒光的細胞，表達可維持至8d后，且于-20℃保存了1個月的仍具有轉染能力；PEI介導的表達量高于殼聚糖/質(zhì)粒DNA顆粒，但其表達維持的時間短于殼聚糖/質(zhì)粒DNA納米顆粒溶液組。在體內(nèi)表達時，

5、發(fā)現(xiàn)殼聚糖/質(zhì)粒DNA納米顆粒盡管初使表達水平低于PEI介導的水平，但其表達所維持的時間卻長于PEI的時間，且表達量呈現(xiàn)出穩(wěn)定的緩慢增高的趨勢，體現(xiàn)了殼聚糖/質(zhì)粒DNA納米顆粒緩釋的特點。殼聚糖/質(zhì)粒DNA納米顆粒作為基因疫苗的遞送載體時，能使機體產(chǎn)生很高的免疫應答和抗體的效價，其效果顯著，好于PEI介導產(chǎn)生的免疫水平。 本研究結果表明，殼聚糖/質(zhì)粒DNA納米顆粒具有傳遞質(zhì)粒DNA進入機體，允許基因緩慢釋放，有效地使基因長期表達