全基因組篩選胰腺癌耐藥相關(guān)基因.pdf

1、目的:通過可四環(huán)素調(diào)控的全基因組隨機突變的方法,篩選胰腺癌健擇(GEM,Gemcitabine)耐藥的關(guān)鍵基因和遺傳通路,同時結(jié)合干細(xì)胞研究技術(shù),深入了解胰腺癌化療耐藥的分子機制及其與腫瘤干細(xì)胞之間的可能聯(lián)系,以確定新的聯(lián)合治療的靶點,為胰腺癌提供新的治療策略。
　　 方法:首先將含有四環(huán)素基因調(diào)控系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄激活子(transactivator,tTA)的質(zhì)粒通過脂質(zhì)體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1和CAPAN-1細(xì)胞中,經(jīng)

2、熒光素酶報告基因檢測建立可調(diào)控的Tet-off穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系,再構(gòu)建含有tTA結(jié)合元件(tet Operater,tetO)的piggyBac質(zhì)粒,通過電穿孔共轉(zhuǎn)染的將piggyBac質(zhì)粒和mPB質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Tet-off穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系,通過G418藥物篩選獲得全基因組范圍內(nèi)的隨機基因突變文庫。在四環(huán)素存在或者不存在時,對GEM反應(yīng)的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義的細(xì)胞表型,通過自連克隆法或Splinkerete PCR法進(jìn)行基因克隆及相關(guān)的功能驗證；

3、同時結(jié)合干細(xì)胞相關(guān)技術(shù),通過piggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)將四個干細(xì)胞相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)入Tet-off穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系中,誘導(dǎo)干細(xì)胞樣細(xì)胞形成,觀察其對GEM的藥物反應(yīng)的變化。
　　 結(jié)果:建立了三個Tet-off穩(wěn)定表達(dá)且可調(diào)控的胰腺癌細(xì)胞系,即PC68-PANC1,PC248-PANC1和2D2-CAPAN-1細(xì)胞系；成功構(gòu)建了piggyBac基因搜尋載體TNO—PB,其Tet-off穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系中,建立全基因組隨機基因突變文庫

4、；篩選對GEM的反應(yīng)在Dox調(diào)控下有顯著性差異的細(xì)胞克隆12個,進(jìn)一步基因克隆得到初步的結(jié)果,并將克隆到的6個基因進(jìn)行染色體定位和功能分析。同時通過piggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)將攜帶四個干細(xì)胞相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子(Oct-3/4,Sox2,c-Myc和Klf4)和tetO的目的基因成功轉(zhuǎn)染進(jìn)入CAPAN-1—2D2細(xì)胞株,得到與ES和iPS細(xì)胞克隆形態(tài)相似的CAPAN-1-2D2/iPS樣細(xì)胞克隆,對CAPAN-1-2D2/iPS樣細(xì)胞克隆進(jìn)行堿

5、性磷酸酶顯色和X-gal檢測,結(jié)果呈陽性。
　　 結(jié)論:PANC-1-PC68,PANC-1-PC248和CAPAN-1—2D2是人胰腺癌Tet-off穩(wěn)定高表達(dá)的細(xì)胞系。以此為基礎(chǔ)建立的隨機基因敲除調(diào)控技術(shù)平臺是進(jìn)行胰腺癌化療耐藥相關(guān)基因篩選行之有效的方法,我們在現(xiàn)有基礎(chǔ)之上將擴大突變文庫的容量,增加胰腺癌化療耐藥相關(guān)基因的篩選范圍,進(jìn)一步進(jìn)行候選基因的功能驗證及克隆其它的GEM耐藥相關(guān)基因；通過Oct-3/4、Sox2、c-