利用基因芯片技術(shù)研究胰腺癌相關(guān)基因.pdf

1、研究目的:(一)以胰腺癌臨床切除標(biāo)本為研究對(duì)象,利用基因芯片技術(shù)對(duì)胰腺癌相關(guān)基因進(jìn)行大規(guī)模篩選.(二)研究SARP-1基因在臨床胰腺腺癌切除標(biāo)本及胰腺癌細(xì)胞株中的表達(dá),探討其在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用.(三)探討構(gòu)建反義SARP-1基因真核表達(dá)載體的可能性.(四)研究反義SARP-1基因?qū)σ认侔┘?xì)胞株P(guān)anc-1體外、體內(nèi)生物學(xué)特性的影響,探討反義SARP-1基因用于基因治療的可能性.研究?jī)?nèi)容:(一)收集臨床胰腺癌手術(shù)切除標(biāo)本,分別用胰

2、腺癌組織及癌旁組織mRNA逆轉(zhuǎn)錄標(biāo)記探針,進(jìn)行芯片雜交,篩選胰腺癌與癌旁組織差異表達(dá)基因,分析差異表達(dá)基因及其相互關(guān)系.(二)對(duì)差異表達(dá)顯著的SARP-1基因,運(yùn)用RT-PCR方法檢測(cè)其在臨床14例胰腺癌及癌旁組織中的表達(dá)情況,驗(yàn)證芯片結(jié)果,并用該方法檢測(cè)人胰腺癌細(xì)胞Panc-1、SW1990和Patu8988中該基因的表達(dá)情況;原位雜交方法檢測(cè)胰腺癌標(biāo)本中SARP-1基因mRNA的表達(dá),并檢測(cè)標(biāo)本中PCNA抗原表達(dá)及TUNEL法檢測(cè)標(biāo)

3、本中細(xì)胞凋亡情況,分析標(biāo)本中SARP-1基因表達(dá)與胰腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的關(guān)系.(三)利用限制性?xún)?nèi)切酶KpnⅠ和NotⅠ雙酶切體系,構(gòu)建含有反義SARP-1基因的真核表達(dá)載體pcDNA3.1-AS-SARP-1的重組質(zhì)粒.(四)用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染方法將構(gòu)建的反義SARP-1基因真核表達(dá)載體導(dǎo)入培養(yǎng)的Panc-1細(xì)胞,經(jīng)G418篩選,用Northern blot方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染空載體對(duì)照組細(xì)胞和轉(zhuǎn)染反義SARP-1基因真核表達(dá)載體實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中SA

4、RP-1基因mRNA的表達(dá),Western blot方法檢測(cè)兩組細(xì)胞中β-catenin蛋白表達(dá),繪制兩組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、MTT法檢測(cè)兩組細(xì)胞增殖活性,用轉(zhuǎn)染空載體對(duì)照組細(xì)胞和轉(zhuǎn)染反義SARP-1基因真核表達(dá)載體實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞接種4周齡Balb/c裸鼠,每組6只,觀察成瘤情況,一周后成瘤,腹腔內(nèi)注射5-Fu 50mg/kg,用藥2周后處死,運(yùn)用原位雜交技術(shù)檢測(cè)成瘤SARP-1基因mRNA的表達(dá),TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況,探討反義SARP-

5、1基因治療胰腺癌的可能性.研究結(jié)論:(一)基因芯片技術(shù)作為一種新興的生物學(xué)技術(shù),以其快速、準(zhǔn)確、高通量的檢測(cè)多種基因的表達(dá)、突變和多態(tài)性,從而達(dá)到高效篩選差異表達(dá)基因的目的,為篩選胰腺癌相關(guān)基因及基因治療研究方面提供了強(qiáng)有力的工具.(二)與癌旁組織相比,胰腺癌組織中SARP-1基因存在明顯高表達(dá),并在Panc-1、SW1990兩株人胰腺癌細(xì)胞株中表達(dá).SARP-1基因mRNA表達(dá)與增殖活性增高、凋亡減少有關(guān).(三)成功構(gòu)建了含有反義SA