HBV相關肝病的全基因組關聯研究.pdf

1、乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是最常見的病毒性傳染病之一，全球大約有2.5億HBV慢性攜帶者。HBV感染可能誘發(fā)一系列肝臟疾病，對我國人民的生命健康造成嚴重威脅。HBV感染后的臨床轉歸存在明顯的個體差異，僅有少部分個體在感染HBV后逐步進展為慢性乙型肝炎、肝硬化甚至肝癌。例如，成年個體感染HBV后，絕大多數個體可以清除病毒，僅有少部分個體會發(fā)展成為持續(xù)性感染者；又如，慢性HBV攜帶者中，僅有少部分個體最終

2、會罹患肝癌。分離分析和雙生子研究提示，遺傳因素在HBV感染后的一系列病程轉歸中發(fā)揮重要作用。系統(tǒng)性發(fā)現HBV相關肝病的遺傳易感基因，對HBV感染后的防治工作具有重要意義。全基因組關聯研究是發(fā)掘復雜疾病易感基因的重要方法。本文針對HBV感染后的兩個重要階段（HBV感染慢性化和HBV相關肝癌）進行全基因組關聯研究，以期發(fā)現上述兩個重要階段潛在的遺傳易感基因。
　　基于全基因組關聯研究策略，研究人員在亞洲人群中已陸續(xù)發(fā)現了8個HBV感染

3、慢性化遺傳易感區(qū)域，包括HLA-DP（rs3077和rs9277535）、HLA-DQ（rs2856718and rs7453920）、HLA-C（rs3130542）、EHMT2（rs652888）、TCF19（rs1419881）、CFB(rs12614)、UBE2L3（rs4821116）和CD40(rs1883832)。為進一步發(fā)掘新的HBV感染慢性化遺傳易感基因，我們在中國人群中開展了全基因組關聯研究。在本項全基因組關聯研究的

4、發(fā)掘階段，我們使用了來自廣西、廣東和江蘇的1,251例HBV持續(xù)性感染患者（病例）和1,057例自限性恢復者（對照）。我們重復出以往報道的與HBV感染慢性化相關的HLA-DP、HLA-DQ、CFB和CD40區(qū)域。同時，我們還重復出以往報道的與HBV感染慢性化相關的HLA等位基因。隨后，我們選擇73個在發(fā)掘階段顯著關聯且以往未被報道的SNP位點，進入驗證階段研究。在驗證階段，我們分別使用了來自江蘇、廣東、廣西和北京的四個獨立人群，共計3,

5、905例病例和3,356例對照。通過驗證，我們發(fā)現了位于6p21.33區(qū)域COL11A2基因上的SNP位點rs9277934以及位于8p21.3區(qū)域基因間區(qū)的SNP位點rs7000921與HBV感染慢性化顯著相關（合并OR=0.81和0.78,合并P=6.0×10-11和3.2×10-12）。這兩個顯著信號均達到了全基因組水平的顯著性閾值（5×10-8）。同時，兩個位點與個體的性別和年齡均不存在交互作用。
　　位于6p21.33區(qū)

6、域的SNP位點rs9277934是COL11A2基因上的非同義變異位點（Glu276Lys）。該基因所在的膠原蛋白相關途徑通路與免疫調控密切相關，提示COL11A2基因可能是6p21.33區(qū)域與HBV感染慢性化相關的候選基因。位于8p21.3區(qū)域的SNP位點rs7000921位于基因間區(qū)。我們使用表達數量性狀基因座（expression Quantitative Trait Loci，eQTL）分析方法，發(fā)現rs7000921的保護性等

7、位與該區(qū)域INTS10基因的上調表達顯著相關，提示INTS10基因可能是8p21.3區(qū)域與HBV感染慢性化相關的候選基因。進而我們通過體外實驗證明了INTS10基因能夠抑制肝臟細胞系中的HBV復制。我們基于肝臟基因表達譜數據進行聚類分析，發(fā)現在INTS10基因高表達組中，RIG-I樣受體信號通路顯著上調表達，提示INTS10基因可能通過RIG-I樣受體信號通路發(fā)揮抑制HBV復制的功能。該假設在后續(xù)的體外機制實驗中得到驗證，INTS10基

8、因可通過IRF3發(fā)揮抑制HBV復制的功能。進一步，在臨床相關性研究中，我們發(fā)現，在病例的血漿樣本中，INTS10蛋白表達顯著低于對照。同時，INTS10蛋白表達與血漿HBV DNA載量呈顯著負性相關。這些結果證明，INTS10基因可能是一個抗HBV基因。
　　綜上，本項全基因組關聯研究發(fā)現了兩個與HBV感染密切相關的候選基因。這些發(fā)現可能為HBV感染的防治提供理論基礎。
　　此外，利用全基因組關聯研究的策略，我們和其他研究小

9、組相繼發(fā)現了1p36.22、2q32.3、6p21.32和21q21.3區(qū)域是HBV相關肝癌的遺傳易感區(qū)域。但是，這些已發(fā)現的位點只能解釋一小部分HBV相關肝癌的易感性，更多的遺傳易感基因有待被發(fā)掘。為了發(fā)現新的HBV相關肝癌遺傳易感區(qū)域，我們合并使用基于核心家系和基于病例-對照的研究策略，在中國人群中開展了新一輪的全基因組關聯研究。在本項全基因組關聯研究的發(fā)掘階段，我們對205個HBV相關肝癌的核心家系（每個家系包含一個肝癌患者與其健

10、康雙親，共205個家系×3人/家系=615人）進行全基因組SNP分型。此外，我們以往開展的HBV相關肝癌的全基因組關聯研究已對348例HBV相關肝癌患者（病例）和359例慢性HBV攜帶者（對照）進行了全基因組SNP分型。在本研究中，我們將以上兩個全基因組SNP數據集合進行了合并分析。結果顯示，我們重復出以往報道的與HBV相關肝癌顯著關聯的SNP，包括位于KIF1B、HLA-DQA1/DRB1、HLA-DQ和BACH2基因區(qū)域的SNP。此

11、外，許多以往報道的與HBV感染后其它表型相關的SNP，在本項研究中也被證明與HBV相關肝癌顯著相關，提示HBV感染后不同表型的遺傳病因具有一定的相似性。隨后，我們選擇14個在發(fā)掘階段顯著關聯且以往未被報道的SNP，進入驗證階段研究。在驗證階段，我們分兩階段進行驗證。這兩個階段共包含五個獨立人群，共計2,280例病例和2,004例對照。經過驗證，我們發(fā)現在7q21.13區(qū)域的CDK14基因上存在顯著關聯信號（標記SNP：rs1027385

12、9，合并OR=1.30,合并P=2.63×10-8）。該SNP的關聯程度達到了全基因組水平的顯著性閾值（5×10-8）。該SNP與個體的性別和年齡不存在交互作用。隨后，我們在三個獨立的樣本集中證明了rs10272859基因型與肝癌患者的生存期顯著相關。進一步的分析顯示，在肝癌組織樣本中，rs10273859的風險等位G等位與CDK14基因的高表達顯著相關。同時，染色體構象捕獲實驗表明，在肝臟細胞系中，CDK14基因啟動子區(qū)域與7q21.