胰腺癌相關(guān)基因篩選和T-BOX2基因在胰腺癌中表達(dá)意義和信號通路的研究.pdf

1、目的：胰腺癌是一種高度惡性的消化道腫瘤,近年來其發(fā)病率國內(nèi)外均有明顯升高的趨勢。在歐美胰腺癌死亡率在所有的惡性腫瘤中居第五位,在消化道癌中胰腺癌的發(fā)病率和死亡率僅次于結(jié)直腸癌,居第二位。在我國胰腺癌是死亡率第6位的常見惡性腫瘤。胰腺癌惡性程度高,起病隱匿,不易早期發(fā)現(xiàn),臨床診斷病例時(shí)多為中晚期,患者預(yù)后差,術(shù)后5年生存率低,迄今無論是早期診斷還是治療均是最困難的惡性腫瘤之一。目前研究認(rèn)為,胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)多基因參與、多階段發(fā)展的

2、過程,它與眾多基因的表達(dá)及相互作用有關(guān),而這些基因的表達(dá)是決定胰腺癌表型多樣性的分子基礎(chǔ)。因此從基因水平研究胰腺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)理,并選擇胰腺癌特異性基因進(jìn)行早期診斷和基因治療已成為這一領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)?；蛐酒夹g(shù)是近年來新興的一項(xiàng)生物技術(shù),它是利用芯片技術(shù)中信息集成化和平行處理化原理,收集成千上萬個(gè)特定的寡核苷酸或DNA片段有序地高密度地排列在特定載體上,通過堿基互補(bǔ)配對原理進(jìn)行雜交。利用基因芯片可以進(jìn)行高通量的生物信息處理,確定腫瘤細(xì)

3、胞的基因表達(dá)譜,尋找新的腫瘤相關(guān)基因及關(guān)鍵性調(diào)控基因,以及應(yīng)用于腫瘤的基因診斷。本研究就是通過基因芯片技術(shù)篩選出胰腺癌表達(dá)差異的基因:對表達(dá)顯著差異的‘TBX2進(jìn)行基因和蛋白水平的檢測;分析TBX2表達(dá)情況與胰腺癌臨床病理特征的關(guān)系;探討TBX2基因在胰腺癌中所參與的信號通路。
　　 材料和方法：
　　 1、應(yīng)用基因芯片技術(shù)檢測胰腺癌及癌旁正常組織中基因變化情況。
　　 方法:取組織標(biāo)本,提取總RNA,cDNA合

4、成,標(biāo)記及純化,芯片雜交及洗脫,芯片檢測。
　　 2、對表達(dá)顯著差異的候選基因,通過生物信息學(xué)查閱各基因的研究現(xiàn)狀,進(jìn)一步挖掘潛在的生物信息,篩選出胰腺癌下一步研究的目的基因。rBX2。
　　 3、采用RT-PCR方法,檢測胰腺癌和癌旁正常組織中表達(dá)顯著差異的目的基因TBX2的mRNA變化情況。方法:取組織標(biāo)本,提取總RNA,擴(kuò)增目的基因,觀察TBX2在mRNA水平的變化情況。
　　 4、采用Western bl

5、ot方法,檢測胰腺癌和癌旁正常組織中表達(dá)顯著差異的目的基因TBX2的蛋白表達(dá)情況。方法:提取蛋白,SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜,免疫反應(yīng),觀察TBX2在蛋白水平的表達(dá)變化。
　　 5、采用免疫組織化學(xué)ABC法檢測胰腺癌和癌旁正常組織中TBX2的表達(dá)程度,分析其與胰腺癌發(fā)生部位、腫瘤大小、病理分化、腫瘤轉(zhuǎn)移、臨床分期、患者年齡及性別等臨床病理特征之間的關(guān)系。
　　 6、用Janus激酶抑制劑AG490阻斷胰腺癌細(xì)胞株AsPC

6、-1的STAT3信號通路,應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測TBX2基因與STAT3通路之間的關(guān)系。
　　 方法:細(xì)胞培養(yǎng),提取RNA,cDNA的合成,熒光實(shí)時(shí)定量PCR來觀察TBX2基因與STAT3基因的變化情況。
　　 結(jié)果：
　　 1、胰腺癌基因表達(dá)譜芯片顯示各克隆點(diǎn)點(diǎn)樣均勻,雜交信號穩(wěn)定,按基因芯片差異顯著陽性標(biāo)準(zhǔn),篩選出胰腺癌組織中差異表達(dá)(Ratio值＞2或＜0.5)基因155種,其中表達(dá)上調(diào)的92種,表達(dá)下

7、調(diào)63種,涉及到細(xì)胞周期調(diào)控基因、癌基因與抑癌基因、腫瘤細(xì)胞凋亡基因、轉(zhuǎn)錄因子及調(diào)控基因、細(xì)胞生長和分化基因、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因、細(xì)胞骨架和細(xì)胞粘附基因等多種基因類型的改變。其中Ratio值＞3和＜0.333倍差異表達(dá)的基因12種,結(jié)合生物信息學(xué)檢索,對顯著差異表達(dá)基因的研究現(xiàn)狀進(jìn)行逐一分析,篩選出胰腺癌進(jìn)一步研究的目的基因TBX2。
　　 2、采用RT-PCR方法檢測胰腺癌與癌旁正常組織中TBX2基因mRNA的水平,采用Wester

8、n blot方法檢測胰腺癌與癌旁正常組織中TBX2基因蛋白的表達(dá)情況。研究結(jié)果表明,在胰腺癌組織中TBX2的mRNA和蛋白表達(dá)均較癌旁正常組織有明顯增加(P＜0.05)。一方面驗(yàn)證了前面基因芯片篩選結(jié)果的可靠性,另一方面為下面胰腺癌臨床病理關(guān)系的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 3、通過免疫組織化學(xué)染色ABC法,有29例(60.4％)胰腺癌標(biāo)本可見免疫組化染色呈強(qiáng)表達(dá),而在正常胰腺標(biāo)本中沒有發(fā)現(xiàn)強(qiáng)表達(dá)的免疫組化染色。TBX2在胰腺癌組織

9、中強(qiáng)表達(dá)例數(shù)明顯高于正常胰腺標(biāo)本。通過。TBX2與胰腺癌臨床病理特征關(guān)系的觀察發(fā)現(xiàn),已發(fā)生轉(zhuǎn)移的胰腺癌病例TBX2表達(dá)高于沒有轉(zhuǎn)移的病例,提示TBX2的表達(dá)與胰腺癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。存低分化腫瘤中TBX2表達(dá)明顯高于中高分化腫瘤,提示TBX2表達(dá)與腫瘤分化程度相關(guān)。在TNM分期中胰腺癌晚期病例TBX2的表達(dá)較中早期病例更為顯著。而TBX2表達(dá)變化在患者年齡、性別、腫瘤直徑和發(fā)生位置等方面無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 4、實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)

10、表明AG490可以明顯抑制胰腺癌細(xì)胞株.AsPC-1中STAT3和TBX2 mRNA的水平。AG490作用于AsPC-1細(xì)胞48小時(shí)后,抑制劑濃度為5μmol/L組的STAT3和TBX2的mRNA相對變化略低于對照組;抑制劑濃度為10μmol/L組的STAT3和TBX2的mRNA相對變化明顯低于對照組(P＜0.05);抑制劑濃度為20μmol/L組的STAT3和TBX2的mRNA相對變化更低于對照組(P＜0.01),經(jīng)過雙變量相關(guān)分析證

11、實(shí)STAT3與TBX2兩者呈正相關(guān)。
　　 結(jié)論：
　　 1、通過基因芯片技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn),并應(yīng)用RT-PCR、Western blot方法驗(yàn)證TBX2在胰腺癌組織中存在高表達(dá),TBX2在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中很可能具有重要作用。
　　 2、TBX2表達(dá)變化與胰腺癌病理分化、腫瘤轉(zhuǎn)移、臨床分期相關(guān),增高的TBX2表達(dá)能夠反映組織表型變化和病程進(jìn)展情況,有助于胰腺癌診斷和預(yù)后的判斷。
　　 3、TBX2可能通過STA