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文檔簡(jiǎn)介
1、解決大面積深度燒傷創(chuàng)面快速、永久性覆蓋問題以及如何促進(jìn)慢性創(chuàng)面愈合,從而減輕傷員的痛苦、提高創(chuàng)面愈合質(zhì)量和降低社會(huì)醫(yī)療負(fù)擔(dān)等方面有著重要的現(xiàn)實(shí)意義。近二十年來,皮膚組織工程和干細(xì)胞的研究進(jìn)展為創(chuàng)面的修復(fù)提供了新思路。但是,目前研制的組織工程皮膚不但價(jià)格昂貴,而且功能缺陷,不能實(shí)現(xiàn)皮膚完美修復(fù)。人們發(fā)現(xiàn),真皮重建能提高創(chuàng)面的愈合質(zhì)量,要實(shí)現(xiàn)組織工程皮膚的完美修復(fù),首先從構(gòu)建功能完備的真皮入手。真皮組織結(jié)構(gòu)復(fù)雜,必須選擇增殖、分化潛能旺盛的
2、干細(xì)胞為種子細(xì)胞來重建真皮。組織中的干細(xì)胞數(shù)量少,干細(xì)胞的特性難以維持。因此選擇何種干細(xì)胞以及如何簡(jiǎn)便快捷地獲取足夠用量的干細(xì)胞是皮膚組織工程重要研究方向之一。本課題研究不同年齡組人真皮多能干細(xì)胞的分離方法及體外分化特點(diǎn);依據(jù)干細(xì)胞克隆增殖潛能、多向分化、不易老化的生理特性進(jìn)行鑒定;探索干細(xì)胞特別是老年人皮膚來源的多能干細(xì)胞的體外擴(kuò)增方法;在此基礎(chǔ)上,以人血漿為支架,以真皮多能干細(xì)胞為種子細(xì)胞,構(gòu)建真皮再生模板,觀察其對(duì)全層皮膚缺損創(chuàng)面
3、愈合的影響;為以后選擇合適的種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程皮膚或自體細(xì)胞移植用于創(chuàng)面修復(fù)提供理論依據(jù)和方法。 第一部分.不同年齡組人真皮多能干細(xì)胞的分離、鑒定及體外分化特點(diǎn) [目的]研究不同年齡組人真皮多能干細(xì)胞的分離、鑒定及體外分化特點(diǎn)。[方法]取5例胎兒、5例小兒、6例成年人、6例老年人正常皮膚標(biāo)本,采用限制性干細(xì)胞培養(yǎng)基篩選克隆并記錄克隆的數(shù)量和大??;檢測(cè)不同年齡供體克隆細(xì)胞的分子標(biāo)志物nestin、fibronectin、
4、c-Myc、STAT3、TERT、E-Cadherin、Vimentin及PCK蛋白和體外分化情況并定量;篩選的克隆細(xì)胞進(jìn)行單克隆分析;克隆細(xì)胞植入裸鼠皮下,觀察有無致瘤性。[結(jié)果](1)胎兒、小兒、成年人、老年人1cm2皮膚原代培養(yǎng)獲得的懸浮克隆個(gè)數(shù)分別為(20.1±2.5)×102、(15.8±5.7)×102、(10.8±1.29)×102、(6.25±1.37)×102;胎兒>小兒>成年人>老年人。原代克隆直徑分別為(83.33
5、±12.11)μm、(55.45±10.11)μm、(45.71±11.70)μm、(42.14±8.09)μm;胎兒>小兒>成年人、老年人。(2)各組克隆細(xì)胞均能向神經(jīng)元細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化;定量分析發(fā)現(xiàn)胎兒、小兒和成年人、老年人克隆細(xì)胞分別向神經(jīng)元細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞優(yōu)勢(shì)分化。(3)上述懸浮克隆的單個(gè)細(xì)胞具有克隆形成能力;單克隆增殖細(xì)胞亦能多向分化。(4)免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),克隆團(tuán)明顯表達(dá)nes
6、tin、fibronectin、c-Myc、STAT3及TERT蛋白。流式細(xì)胞分析術(shù)發(fā)現(xiàn)98.5±1%的克隆形成細(xì)胞表達(dá)nestin及95.2±1.3%的細(xì)胞表達(dá)fibronectin;克隆形成細(xì)胞不表達(dá)E-Cadherin、Vimentin、NSE、GFAP及PCK蛋白。(5)細(xì)胞活體植入無致瘤性。[結(jié)論]不同年齡組人真皮中具有克隆增殖和多向分化的干細(xì)胞采用限制性干細(xì)胞培養(yǎng)基能夠有效分離;年齡對(duì)人真皮多能干細(xì)胞的數(shù)量、增殖、分化有影響
7、。 第二部分.老年人真皮多能干細(xì)胞的體外有效擴(kuò)增 [目的]探討老年人真皮多能干細(xì)胞體外有效擴(kuò)增方法。[方法]取6例老年人皮膚標(biāo)本,胰酶消化,采用限制性干細(xì)胞培養(yǎng)基和含血清的培養(yǎng)液交替培養(yǎng)進(jìn)行克隆篩選和擴(kuò)增傳代;利用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、克隆分析、細(xì)胞5-溴脫氧尿嘧啶摻入來評(píng)價(jià)擴(kuò)增細(xì)胞的生理特性。[結(jié)果](1)1cm2大的老年人皮膚原代獲得400-600個(gè)細(xì)胞克隆;有效擴(kuò)增后可獲得(2-3)×105個(gè)細(xì)胞克隆/代。(2)克隆細(xì)
8、胞體外可向神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化;單細(xì)胞克隆形成率約20%,也能向上述細(xì)胞分化;克隆細(xì)胞的細(xì)胞核摻入5-溴脫氧尿嘧啶。(3)細(xì)胞克隆明顯表達(dá)nestin、fibronectin、c-Myc、STAT3及TERT蛋白。流式細(xì)胞分析術(shù)發(fā)現(xiàn),克隆形成細(xì)胞不表達(dá)E-Cadherin、Vimentin、NSE、GFAP及PCK蛋白。[結(jié)論]限制性干細(xì)胞培養(yǎng)基和含血清的培養(yǎng)液交替培養(yǎng)是老年人皮膚多能干細(xì)胞分離和擴(kuò)增的有效方法;
9、擴(kuò)增的細(xì)胞仍維持原代的特性。 第三部分.真皮多能干細(xì)胞復(fù)合血漿構(gòu)建真皮再生模板及移植觀察 [目的]以人真皮多能干細(xì)胞為種子細(xì)胞構(gòu)建真皮再生模板,觀察移植后成活狀態(tài)。[方法]5-BrdU標(biāo)記的真皮多能干細(xì)胞接種0型血漿中構(gòu)建真皮模板并作組織學(xué)觀察;裸鼠背部制作全層皮膚缺損創(chuàng)面,真皮模板移植后3、6、9天取材觀察血管化程度;創(chuàng)面上皮化后第1、3周取材,免疫組織化學(xué)檢測(cè)模板中標(biāo)記細(xì)胞的成活狀態(tài)。[結(jié)果](1)干細(xì)胞在血漿中增殖
10、良好;真皮模板為白色生物膜,厚約(500±254)μm。(2)真皮模板中部分細(xì)胞仍表達(dá)nestin;(3)真皮模板植入后第3天,模板下有少量的血管生成;第9天大量細(xì)胞遷入模板中。(4)創(chuàng)面上皮化后第1、3周,皮膚組織的表皮和真皮中可見大量的5-BrdU陽(yáng)性細(xì)胞分布。[結(jié)論]真皮多能干細(xì)胞接種于血漿中構(gòu)建的真皮模板移植后能較快的血管化;真皮模板細(xì)胞在受體組織中能成活下來。 第四部分.真皮再生模板對(duì)全層皮膚缺損創(chuàng)面愈合的影響
11、 [目的]觀察真皮再生模板對(duì)皮膚創(chuàng)面愈合質(zhì)量的影響。[方法]分離培養(yǎng)鼠的真皮多能干細(xì)胞;以血漿為載體構(gòu)建真皮再生模板;60只裸鼠背部制作皮膚缺損創(chuàng)面,隨機(jī)平分為真皮模板移植組(A組)、單純血漿支架組移植(B組)和空白組(C組),記錄創(chuàng)面愈合時(shí)間;創(chuàng)面愈合后第2天,用透明膜描繪法估計(jì)創(chuàng)面的攣縮程度;創(chuàng)面愈合后第1周取材,測(cè)量皮膚的機(jī)械性能;HE染色,光鏡下測(cè)量表皮的厚度;分別在創(chuàng)面愈合后第1、2、4、8周取材進(jìn)行組織學(xué)觀察;免疫熒光檢測(cè)表
12、皮下及真皮層PGP9.5的表達(dá),以此反映皮膚神經(jīng)再生情況。[結(jié)果](1)A組、B組、C組創(chuàng)面愈合時(shí)間分別為(15.7±1.0)d、(19.7±1.44)d、(20.5±1.2)d;A組愈合時(shí)間早于后兩組(p<0.05)。(2)A組、B組、C組創(chuàng)面攣縮的百分率分別為(39.45±4.40)%、(41.63±3.7)%、(51.81±2.67)%,A、B兩組創(chuàng)面攣縮的百分率小于C組(P<0.05);A組創(chuàng)面攣縮的百分率小于B兩,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差
13、異(P>0.05)。(3)A組、B組、C組創(chuàng)面愈合1周后表皮厚度分別為(1051.8±108.1)μm、(801.28±34.34)μm、(510.16±92.98)μm;A組表皮明顯厚于B、C兩組(P<0.01);B組表皮厚于C組(p<0.05)(4)A組、B組、C組創(chuàng)面愈合后1周皮膚的最大中斷拉力分別為(13.87±0.38)N、(11.86±0.57)N、(7.37±0.82)N;A組中斷拉力大于后兩組(P<0.05及0.01);
14、B組大于C組(P<0.01)。三組皮膚拉斷時(shí)所延伸的長(zhǎng)度分別為(12.71±1.81)mm、(11.71±1.23)mm、(5.69±0.61)mm,A、B兩組延伸的長(zhǎng)度大于C組(P<0.01);A、B兩組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。(5)A組創(chuàng)面愈合后第1、2周表皮下及真皮層PGP9.5熒光密度高于B組、C組(p<0.01);B組第2周真皮層和第4周表皮下PGP9.5熒光密度高于C組。(6)創(chuàng)面愈合后第8周,A組新生上皮有少量的短小
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