人真皮多能干細(xì)胞分離擴(kuò)增及真皮再生模板的構(gòu)建研究.pdf

1、解決大面積深度燒傷創(chuàng)面快速、永久性覆蓋問(wèn)題以及如何促進(jìn)慢性創(chuàng)面愈合，從而減輕傷員的痛苦、提高創(chuàng)面愈合質(zhì)量和降低社會(huì)醫(yī)療負(fù)擔(dān)等方面有著重要的現(xiàn)實(shí)意義。近二十年來(lái)，皮膚組織工程和干細(xì)胞的研究進(jìn)展為創(chuàng)面的修復(fù)提供了新思路。但是，目前研制的組織工程皮膚不但價(jià)格昂貴，而且功能缺陷，不能實(shí)現(xiàn)皮膚完美修復(fù)。人們發(fā)現(xiàn)，真皮重建能提高創(chuàng)面的愈合質(zhì)量，要實(shí)現(xiàn)組織工程皮膚的完美修復(fù)，首先從構(gòu)建功能完備的真皮入手。真皮組織結(jié)構(gòu)復(fù)雜，必須選擇增殖、分化潛能旺盛的

2、干細(xì)胞為種子細(xì)胞來(lái)重建真皮。組織中的干細(xì)胞數(shù)量少，干細(xì)胞的特性難以維持。因此選擇何種干細(xì)胞以及如何簡(jiǎn)便快捷地獲取足夠用量的干細(xì)胞是皮膚組織工程重要研究方向之一。本課題研究不同年齡組人真皮多能干細(xì)胞的分離方法及體外分化特點(diǎn)；依據(jù)干細(xì)胞克隆增殖潛能、多向分化、不易老化的生理特性進(jìn)行鑒定；探索干細(xì)胞特別是老年人皮膚來(lái)源的多能干細(xì)胞的體外擴(kuò)增方法；在此基礎(chǔ)上，以人血漿為支架，以真皮多能干細(xì)胞為種子細(xì)胞，構(gòu)建真皮再生模板，觀察其對(duì)全層皮膚缺損創(chuàng)面

3、愈合的影響；為以后選擇合適的種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程皮膚或自體細(xì)胞移植用于創(chuàng)面修復(fù)提供理論依據(jù)和方法。 第一部分.不同年齡組人真皮多能干細(xì)胞的分離、鑒定及體外分化特點(diǎn) [目的]研究不同年齡組人真皮多能干細(xì)胞的分離、鑒定及體外分化特點(diǎn)。[方法]取5例胎兒、5例小兒、6例成年人、6例老年人正常皮膚標(biāo)本，采用限制性干細(xì)胞培養(yǎng)基篩選克隆并記錄克隆的數(shù)量和大?。粰z測(cè)不同年齡供體克隆細(xì)胞的分子標(biāo)志物nestin、fibronectin、

4、c-Myc、STAT3、TERT、E-Cadherin、Vimentin及PCK蛋白和體外分化情況并定量；篩選的克隆細(xì)胞進(jìn)行單克隆分析；克隆細(xì)胞植入裸鼠皮下，觀察有無(wú)致瘤性。[結(jié)果](1)胎兒、小兒、成年人、老年人1cm2皮膚原代培養(yǎng)獲得的懸浮克隆個(gè)數(shù)分別為(20.1±2.5)×102、(15.8±5.7)×102、(10.8±1.29)×102、(6.25±1.37)×102；胎兒＞小兒＞成年人＞老年人。原代克隆直徑分別為(83.33

5、±12.11)μm、(55.45±10.11)μm、(45.71±11.70)μm、(42.14±8.09)μm；胎兒＞小兒＞成年人、老年人。(2)各組克隆細(xì)胞均能向神經(jīng)元細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化；定量分析發(fā)現(xiàn)胎兒、小兒和成年人、老年人克隆細(xì)胞分別向神經(jīng)元細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞優(yōu)勢(shì)分化。(3)上述懸浮克隆的單個(gè)細(xì)胞具有克隆形成能力；單克隆增殖細(xì)胞亦能多向分化。(4)免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，克隆團(tuán)明顯表達(dá)nes

6、tin、fibronectin、c-Myc、STAT3及TERT蛋白。流式細(xì)胞分析術(shù)發(fā)現(xiàn)98.5±1％的克隆形成細(xì)胞表達(dá)nestin及95.2±1.3％的細(xì)胞表達(dá)fibronectin；克隆形成細(xì)胞不表達(dá)E-Cadherin、Vimentin、NSE、GFAP及PCK蛋白。(5)細(xì)胞活體植入無(wú)致瘤性。[結(jié)論]不同年齡組人真皮中具有克隆增殖和多向分化的干細(xì)胞采用限制性干細(xì)胞培養(yǎng)基能夠有效分離；年齡對(duì)人真皮多能干細(xì)胞的數(shù)量、增殖、分化有影響

7、。 第二部分.老年人真皮多能干細(xì)胞的體外有效擴(kuò)增 [目的]探討老年人真皮多能干細(xì)胞體外有效擴(kuò)增方法。[方法]取6例老年人皮膚標(biāo)本，胰酶消化，采用限制性干細(xì)胞培養(yǎng)基和含血清的培養(yǎng)液交替培養(yǎng)進(jìn)行克隆篩選和擴(kuò)增傳代；利用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、克隆分析、細(xì)胞5-溴脫氧尿嘧啶摻入來(lái)評(píng)價(jià)擴(kuò)增細(xì)胞的生理特性。[結(jié)果](1)1cm2大的老年人皮膚原代獲得400-600個(gè)細(xì)胞克??；有效擴(kuò)增后可獲得(2-3)×105個(gè)細(xì)胞克隆/代。(2)克隆細(xì)

8、胞體外可向神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化；單細(xì)胞克隆形成率約20％，也能向上述細(xì)胞分化；克隆細(xì)胞的細(xì)胞核摻入5-溴脫氧尿嘧啶。(3)細(xì)胞克隆明顯表達(dá)nestin、fibronectin、c-Myc、STAT3及TERT蛋白。流式細(xì)胞分析術(shù)發(fā)現(xiàn)，克隆形成細(xì)胞不表達(dá)E-Cadherin、Vimentin、NSE、GFAP及PCK蛋白。[結(jié)論]限制性干細(xì)胞培養(yǎng)基和含血清的培養(yǎng)液交替培養(yǎng)是老年人皮膚多能干細(xì)胞分離和擴(kuò)增的有效方法；

9、擴(kuò)增的細(xì)胞仍維持原代的特性。 第三部分.真皮多能干細(xì)胞復(fù)合血漿構(gòu)建真皮再生模板及移植觀察 [目的]以人真皮多能干細(xì)胞為種子細(xì)胞構(gòu)建真皮再生模板，觀察移植后成活狀態(tài)。[方法]5-BrdU標(biāo)記的真皮多能干細(xì)胞接種0型血漿中構(gòu)建真皮模板并作組織學(xué)觀察；裸鼠背部制作全層皮膚缺損創(chuàng)面，真皮模板移植后3、6、9天取材觀察血管化程度；創(chuàng)面上皮化后第1、3周取材，免疫組織化學(xué)檢測(cè)模板中標(biāo)記細(xì)胞的成活狀態(tài)。[結(jié)果](1)干細(xì)胞在血漿中增殖

10、良好；真皮模板為白色生物膜，厚約(500±254)μm。(2)真皮模板中部分細(xì)胞仍表達(dá)nestin；(3)真皮模板植入后第3天，模板下有少量的血管生成；第9天大量細(xì)胞遷入模板中。(4)創(chuàng)面上皮化后第1、3周，皮膚組織的表皮和真皮中可見(jiàn)大量的5-BrdU陽(yáng)性細(xì)胞分布。[結(jié)論]真皮多能干細(xì)胞接種于血漿中構(gòu)建的真皮模板移植后能較快的血管化；真皮模板細(xì)胞在受體組織中能成活下來(lái)。 第四部分.真皮再生模板對(duì)全層皮膚缺損創(chuàng)面愈合的影響

11、 [目的]觀察真皮再生模板對(duì)皮膚創(chuàng)面愈合質(zhì)量的影響。[方法]分離培養(yǎng)鼠的真皮多能干細(xì)胞；以血漿為載體構(gòu)建真皮再生模板；60只裸鼠背部制作皮膚缺損創(chuàng)面，隨機(jī)平分為真皮模板移植組(A組)、單純血漿支架組移植(B組)和空白組(C組)，記錄創(chuàng)面愈合時(shí)間；創(chuàng)面愈合后第2天，用透明膜描繪法估計(jì)創(chuàng)面的攣縮程度；創(chuàng)面愈合后第1周取材，測(cè)量皮膚的機(jī)械性能；HE染色，光鏡下測(cè)量表皮的厚度；分別在創(chuàng)面愈合后第1、2、4、8周取材進(jìn)行組織學(xué)觀察；免疫熒光檢測(cè)表

12、皮下及真皮層PGP9.5的表達(dá)，以此反映皮膚神經(jīng)再生情況。[結(jié)果](1)A組、B組、C組創(chuàng)面愈合時(shí)間分別為(15.7±1.0)d、(19.7±1.44)d、(20.5±1.2)d；A組愈合時(shí)間早于后兩組(p＜0.05)。(2)A組、B組、C組創(chuàng)面攣縮的百分率分別為(39.45±4.40)％、(41.63±3.7)％、(51.81±2.67)％，A、B兩組創(chuàng)面攣縮的百分率小于C組(P＜0.05)；A組創(chuàng)面攣縮的百分率小于B兩，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差

13、異(P＞0.05)。(3)A組、B組、C組創(chuàng)面愈合1周后表皮厚度分別為(1051.8±108.1)μm、(801.28±34.34)μm、(510.16±92.98)μm；A組表皮明顯厚于B、C兩組(P＜0.01)；B組表皮厚于C組(p＜0.05)(4)A組、B組、C組創(chuàng)面愈合后1周皮膚的最大中斷拉力分別為(13.87±0.38)N、(11.86±0.57)N、(7.37±0.82)N；A組中斷拉力大于后兩組(P＜0.05及0.01)；

14、B組大于C組(P＜0.01)。三組皮膚拉斷時(shí)所延伸的長(zhǎng)度分別為(12.71±1.81)mm、(11.71±1.23)mm、(5.69±0.61)mm，A、B兩組延伸的長(zhǎng)度大于C組(P＜0.01)；A、B兩組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。(5)A組創(chuàng)面愈合后第1、2周表皮下及真皮層PGP9.5熒光密度高于B組、C組(p＜0.01)；B組第2周真皮層和第4周表皮下PGP9.5熒光密度高于C組。(6)創(chuàng)面愈合后第8周，A組新生上皮有少量的短小