真皮多能干細胞參與創(chuàng)傷愈合機制的實驗研究.pdf

1、干細胞是指未成熟細胞，具有自我更新和分化能力，在一定的誘導條件下，可以分化為其他細胞、組織及器官。干細胞可分為胚胎干細胞(embryonicstemcell，ES細胞)和成體干細胞(Adultstemcells)，它們在細胞療法、基因治療、發(fā)育學研究、藥理及毒理學等研究中已顯示出無可比擬的作用和優(yōu)越性。成體干細胞是存在于發(fā)育成熟個體組織中的可自我更新和分化為原組織所有細胞類型的未分化細胞[4]。其中存在于骨髓基質中的間充質干細胞(mes

2、enchymalstemcells)是研究最早和最為深入的一類多能干細胞，其來源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層，具有廣泛的分化潛能，并已經在多種疾病和損傷的試驗性治療中顯示出良好前景。 我們在前期成體干細胞研究基礎上，成功分離大鼠真皮多能干細胞(dermalMultipotentStemCellsdMSCs)，初步研究提示真皮多能干細胞是一種重要的參與創(chuàng)傷修復啟動的組織修復細胞。為了深入研究真皮多能干細胞參與創(chuàng)傷修復啟動的分子機制，

3、屈紀富等構建了傷口液作用前后真皮多能干細胞差異表達cDNA文庫，為進一步篩選、克隆與真皮多能干細胞參與創(chuàng)傷修復相關的差異表達基因奠定了基礎。 本實驗首先對真皮多能干細胞進行分離、培養(yǎng)和鑒定；接著觀察了真皮多能干細胞對傷后不同時相傷口液的反應性變化，以探討真皮多能干細胞在創(chuàng)傷愈合中的意義；然后通過菌液PCR擴增抑制消減雜交文庫中485個克隆的插入片斷，制作基因芯片對文庫中的克隆進行反向鑒定，對陽性克隆測序并進行生物信息學分析，再通

4、過體外實驗(創(chuàng)傷早期傷口液作用真皮多能干細胞前后相應基因或蛋白的表達變化)和整體實驗(觀察正常大鼠皮膚和創(chuàng)傷后大鼠傷口皮膚組織表達相應基因或蛋白的變化)兩個方面觀察所篩選的基因表達變化，以初步驗證這些差異表達基因在創(chuàng)傷愈合中的意義；最后，我們選擇分泌性白細胞蛋白酶抑制因子(SecretoryleukocyteproteaseinhibitorSLPI)進行研究，初步研究了SLPI對真皮多能干細胞的促增殖作用及其可能的機制。 主要

5、結果和結論如下： 1.本實驗分離、純化的真皮多能干細胞形態(tài)較為均一，多次傳代后仍能保持很強的增殖能力；在一定的誘導條件下，真皮多能干細胞具有向成骨細胞、脂肪細胞和肌細胞分化的能力，這些結果提示，真皮多能干細胞具有自我更新能力和多向分化潛能，是一種較為原始和幼稚的間充質多能干細胞。傷后不同時相傷口液對真皮多能干細胞均具有刺激作用，表現(xiàn)為真皮多能干細胞增殖力和遷移力均顯著增加，但傷后早期傷口液作用最為明顯，提示真皮多能干細胞不僅是一

6、種重要的組織修復細胞，而且在創(chuàng)傷修復啟動中可能具有重要意義。 2..我們通過基因芯片對已經獲得的cDNA消減文庫進行篩選和鑒定，得到13個創(chuàng)傷早期傷口液作用真皮多能干細胞高表達的靶分子，測序得到SLPI、中性粒細胞趨化因子-2(CINC-2(等7個已知序列的差異表達基因。這些差異表達基因的發(fā)現(xiàn)對于從基因水平闡明創(chuàng)傷愈合的分子機制可能具有重要意義，可望為創(chuàng)傷促愈措施提供新思路和新靶點。 3.RT-PCR提示傷口局部皮膚組織

7、和傷口液作用24h后真皮多能干細胞中SLPI，CINC-2mRNA含量均顯著升高，免疫組織化學結果提示傷口液作用后真皮多能干細胞中熱休克蛋白70(HSP70)，基質金屬蛋白酶3(MMP3)蛋白表達顯著增強。結合參考文獻和對差異表達基因的初步研究，我們預測SLPI、CINC-2、MMP3和HSP70在創(chuàng)傷愈合中有重要意義。 4.通過[H3]Thymidine摻入實驗發(fā)現(xiàn)加入SLPI后，細胞有絲分裂顯著增強。RT-PCR提示在SLP