小鼠支持細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的研究.pdf

1、體細(xì)胞異位表達(dá)特異性轉(zhuǎn)錄因子可以重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPS細(xì)胞)。iPS細(xì)胞不僅具有與胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ES細(xì)胞)相同的多能性和自我更新能力，還可以避免臨床治療過程中的免疫排斥和各種倫理道德問題。因此，iPS細(xì)胞技術(shù)不僅為科研基礎(chǔ)理論研究提供了新的技術(shù)手段，也為再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域帶來了廣闊的應(yīng)用前景。目前，盡管已經(jīng)獲得多種體細(xì)胞來源的iPS細(xì)

2、胞，但不同來源的iPS細(xì)胞質(zhì)量參差不齊，在基因表達(dá)圖圖譜，表觀遺傳修飾及分化能力等方面存在差異。因此，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的體細(xì)胞是獲得高質(zhì)量、具有發(fā)育全能性的優(yōu)質(zhì)iPS細(xì)胞的前提。
　　小鼠支持細(xì)胞(Sertoli cells)是睪丸的重要組成成分，具有免疫豁免和為生精過程提供適宜微環(huán)境的作用。離體培養(yǎng)時(shí)，支持細(xì)胞增殖速度較快，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，自身表達(dá)Klf4和c-Myc等基因。支持細(xì)胞分離純化后可得到高純度同質(zhì)性細(xì)胞群，排除了異

3、質(zhì)性細(xì)胞群對(duì)重編程實(shí)驗(yàn)的干擾。因此，支持細(xì)胞重編程為iPS細(xì)胞為后續(xù)誘導(dǎo)生精細(xì)胞提供源細(xì)胞。
　　一氧化氮(nitric oxide，NO)是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子，參與干細(xì)胞生長(zhǎng)增殖調(diào)控。NO對(duì)干細(xì)胞調(diào)控呈濃度依賴性，高濃度NO促進(jìn)干細(xì)胞分化，低濃度NO維持干細(xì)胞多能性。探索NO對(duì)iPS細(xì)胞的影響對(duì)iPS細(xì)胞長(zhǎng)期體外增殖分化有重要作用。
　　本實(shí)驗(yàn)主要目的是將小鼠支持細(xì)胞重編程為iPS細(xì)胞并探索NO對(duì)iPS細(xì)胞的影響。分為以下方面

4、:逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的擴(kuò)增與檢測(cè);支持細(xì)胞的分離培養(yǎng)及純化;逆轉(zhuǎn)錄病毒液獲得及感染支持細(xì)胞;iPS克隆獲得及鑒定;低濃度NO對(duì)iPS細(xì)胞的影響。主要研究結(jié)果如下:
　　1.酶切和測(cè)序鑒定證實(shí)了擴(kuò)增的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的準(zhǔn)確性。
　　2.獲得高純度小鼠支持細(xì)胞:通過兩步酶消化法從小鼠睪丸中分離支持細(xì)胞，并且通過密度梯度離心法及差速貼壁法純化小鼠支持細(xì)胞。原代培養(yǎng)的小鼠支持細(xì)胞具有良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，SGP-1、SGP-2、Transfer

5、rin、ABP及AMHII等支持細(xì)胞特異性標(biāo)記物表達(dá)，Klf4和c-Myc表達(dá)水平較低，Nanog、Sox2及Oct4等多能基因不表達(dá)。
　　3.成功構(gòu)建小鼠支持細(xì)胞iPS細(xì)胞系:將四種重編程因子導(dǎo)入支持細(xì)胞，同時(shí)以GFP空載體檢測(cè)病毒感染情況。感染的支持細(xì)胞在3d左右表達(dá)GFP。同時(shí)細(xì)胞開始縮小聚集，失去原有支持細(xì)胞形態(tài)，逐步形成突起樣克隆，18d左右感染的支持細(xì)胞不表達(dá)GFP熒光，形成具有典型干細(xì)胞特性的iPS細(xì)胞。iPS細(xì)胞

6、可以體外長(zhǎng)期增殖并保持正常核型。
　　4.iPS細(xì)胞系鑒定:iPS細(xì)胞AKP染色呈陽(yáng)性，可表達(dá)多種ES細(xì)胞特異性基因，如Nanog、Oct4、Sox2、Rex1、Fbx15、E-cad和Fgf4等，并且表達(dá)水平與ES細(xì)胞相近;Nanog和Oct4免疫染色呈陽(yáng)性。在細(xì)胞周期調(diào)控模式上，iPS細(xì)胞與ES細(xì)胞相近。重編程的iPS細(xì)胞內(nèi)源多能基因激活，外源轉(zhuǎn)錄基因沉默。同時(shí)，iPS細(xì)胞具有分化為多種細(xì)胞的能力。體外培養(yǎng)時(shí)，可形成擬胚體，獲