人臍帶間充質(zhì)干細胞重編程為誘導多能干細胞的基礎研究.pdf

1、【背景與目的】誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells,iPS細胞)是一種具有類似胚胎干細胞(Embryonic stem cell,ES細胞)特性和功能的多能干細胞。iPS細胞來源于自體細胞,具有低免疫原性,且不受倫理問題的制約,因此,其被越來越廣泛的應用于細胞替代治療、疾病機理及藥物篩選研究。盡管如此,尋找更合適的ips細胞來源及安全有效的誘導方案是急需解決的問題。我們的前期研究表明,人臍帶間充質(zhì)

2、干細胞(HUMSCs)自身表達iPS所需部分相關(guān)基因且具有一定的多能性。因此,HUMSCs有可能作為產(chǎn)生iPS細胞的理想來源。本項目旨在探討HUMSCs來源iPS細胞(HUMSC-iPS)的生物學特性及其誘導效率,并建立一套安全而高效的HUMSC-iPS培養(yǎng)途徑,從而為進一步探討HUMSC-iPS的形成機制和分化能力奠定基礎。
　　【材料與方法】
　　(1)采用差異貼壁法分離、培養(yǎng)、擴增出人臍帶間充質(zhì)干細胞;
　　(2

3、)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、測序并擴增;
　　(3)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞,包裝出重組慢病毒液;
　　(4)倒置顯微鏡測定凍存前后病毒液滴度;
　　(5)流式細胞術(shù)檢測病毒感染力;
　　(6)RT-PCR、熒光定量PCR檢測感染后HUMSCs內(nèi)基因表達情況;
　　(7)組織貼壁法原代培養(yǎng)胎鼠成纖維細胞(MEF)及制作MEF飼養(yǎng)層;
　　(8)分別攜帶轉(zhuǎn)錄因子(Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc)的重組慢病毒載體

4、同時感染HUMSCs,嘌呤霉素篩選后,消化鋪入飼養(yǎng)層,觀察克隆的形成。
　　【結(jié)果】
　　(1)質(zhì)粒測序、驗證正確;
　　(2)制備的新鮮病毒液滴度達5×108u/ml,凍存后降為5×106u/ml;
　　(3)新鮮的重組慢病毒對于HUMSCs的感染力高于80％;
　　(4)感染后HUMSCs內(nèi)Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc基因的表達量明顯升高,p<0.05;
　　(5)在四基因轉(zhuǎn)入HUMS