膀胱癌中SNF5基因表達(dá)的分子調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、膀胱癌具有易耐藥、高復(fù)發(fā)性、高異質(zhì)以及高死亡率的生物學(xué)特性，同時它的發(fā)生發(fā)展也是一個多基因多步驟參與的結(jié)果，近年來發(fā)病率有上升的趨勢，已經(jīng)成為世界五大常見癌癥之一，在我國膀胱癌已經(jīng)躍居男性泌尿生殖系腫瘤首位。大量研究顯示，膀胱癌的發(fā)生發(fā)展跟機(jī)體的遺傳性和表觀遺傳性異常表現(xiàn)有很大的關(guān)聯(lián)，這為膀胱癌的早期預(yù)警及后期治療帶來了很多的難題。據(jù)報道內(nèi)外因素促使表觀遺傳發(fā)生改變，從而激活或沉默某些基因，繼而使機(jī)體某些細(xì)胞發(fā)生失控狀態(tài)導(dǎo)致產(chǎn)生腫瘤。染

2、色質(zhì)重塑復(fù)合物(SWI/SNF)是表觀遺傳學(xué)研究的對象之一，它是利用水解ATP獲得能量來改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)，DNA修復(fù)、DNA的甲基化、轉(zhuǎn)錄的激活和抑制以及細(xì)胞周期均與此種復(fù)合物及其相關(guān)蛋白有關(guān)。SNF5作為SWI/SNF的一個核心亞基，已經(jīng)被證實在許多不同的腫瘤中存在突變或者缺失，比如橫紋肌肉瘤、腦、腎及其他軟組織的惡性腫瘤等。
　　目的:
　　課題組前期發(fā)現(xiàn)SNF5在膀胱癌中存在表達(dá)異?，F(xiàn)象，查閱文獻(xiàn)未見其相關(guān)作用機(jī)制報道

3、，所以研究SNF5在膀胱癌中作用機(jī)制，將有助于早期診斷或預(yù)警、獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)的研究奠定重要的實驗基礎(chǔ)。SNF5在膀胱癌中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制不清楚，從非編碼RNA和轉(zhuǎn)錄調(diào)控兩個方面入手進(jìn)行初步研究，
　　方法與結(jié)果:
　　一、非編碼RNA
　　1、鑒定SNF5是miR-206新型靶基因:基于前期生物信息分析，運(yùn)用Luciferace報告基因系統(tǒng)、miR-206模擬物及其抑制物鑒定“SNF5是miR-206的新型靶基因”。

4、>　　2、利用Real-time PCR，免疫組織化學(xué)法檢測臨床膀胱癌組織中miR-206、SNF5在表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)miR-206在癌組織中低表達(dá)(30/38)，而SNF5的mRNA及蛋白水平均高表達(dá)(28/38)，二者呈負(fù)相關(guān)，結(jié)合臨床病理資料分析發(fā)現(xiàn)，SNF5的表達(dá)與膀胱癌臨床病理分級不相關(guān)。
　　二、轉(zhuǎn)錄調(diào)控
　　1、證實“HSF1對SNF5關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用”:前期生物信息學(xué)分析在人SNF5基因5'調(diào)控區(qū)存在著HSF1

5、的可能結(jié)合位點(diǎn);登陸網(wǎng)站http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html，對SNF5基因的5'側(cè)翼區(qū)約3000bp的序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其有與HSF1的結(jié)合位點(diǎn)，選擇膀胱癌細(xì)胞株5637細(xì)胞，瞬時轉(zhuǎn)染高表達(dá)HSF1質(zhì)粒后，westernblot檢測HSF1能明顯促進(jìn)SNF5蛋白表達(dá);采用體內(nèi)ChIP實驗，發(fā)現(xiàn)HSF1可與SNF5啟動子-2304--2696區(qū)域結(jié)合，以上實驗結(jié)果證實HSF1對SNF5

6、的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。
　　2、利用Real-time PCR，免疫組織化學(xué)法大樣本量檢測膀胱癌組織中HSF1、SNF5的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)兩者在癌組織中mRNA及蛋白水平普遍高表達(dá)，二者呈正相關(guān)。
　　結(jié)論:
　　綜上所述，本研究從非編碼RNA和轉(zhuǎn)錄調(diào)控兩個方面研究了SNF5表達(dá)調(diào)控情況，首先利用生物信息學(xué)分析并驗證了SNF5是miR-206新的靶基因以及HSF1是SNF5的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，并通過膀胱癌臨床組織樣本進(jìn)一步驗證