胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白2和4在SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠腰膨大的表達(dá)改變.pdf

1、目的:肌萎縮側(cè)索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一種慢性致死性中樞神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行性變性疾病,以選擇性大腦皮層、腦干及脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元丟失為特征,是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病(Motor Neuron Disease,MND)中最常見的類型[1],也被稱為“神經(jīng)系統(tǒng)的癌癥”。臨床特點(diǎn)是40歲以上的中老年多發(fā),男性較多見,起病緩慢,進(jìn)行性發(fā)展,逐漸出現(xiàn)四肢肌肉無力,萎縮,腱反射可活躍,并可有病理反射,多數(shù)ALS

2、患者在首次癥狀出現(xiàn)后的3～5年內(nèi)因呼吸衰竭而死亡。
　　 根據(jù)其發(fā)病特點(diǎn)分為家族型肌萎縮側(cè)索硬化Familial AmyotrophicLateral Sclerosis,FALS)和散發(fā)型肌萎縮側(cè)索硬化(Sporadic AmyotrophicLateral Sclerosis,SALS)。其中SALS占90％以上,其發(fā)病機(jī)制不清,可能主要與以下幾個(gè)方面有關(guān):1.谷氨酸的興奮毒作用;2.Ca2+超載;3.自由基的毒性作用;4.

3、免疫機(jī)制;5.線粒體功能異常;6.神經(jīng)絲的過度磷酸化;7.神經(jīng)營養(yǎng)因子缺乏。
　　 胰島素樣生長因子作為一種神經(jīng)營養(yǎng)因子對促進(jìn)神經(jīng)元的生存和抑制其凋亡起到重要作用,同時(shí)也可能具有促進(jìn)神經(jīng)元再生的作用,胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白作為特定的載體能夠與之結(jié)合,并對于胰島素樣生長因子的轉(zhuǎn)運(yùn),分布以及半衰期和生物活性的調(diào)節(jié)至關(guān)重要,因此這些結(jié)合蛋白的表達(dá)量的變化很可能會影響其發(fā)揮正常的生物調(diào)節(jié)作用,但目前這類蛋白表達(dá)量的改變在肌萎縮側(cè)索硬化

4、這一疾病上的國內(nèi)未見研究報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)研究目的是檢測肌萎縮側(cè)索硬化模型SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠腰膨大胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白2和4的表達(dá)量,并比較發(fā)病前后的改變。
　　 方法:
　　 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組36只SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠分為同窩對照組、癥狀前期組、癥狀早期組(采用snowG93A肢體評分法規(guī)定臨床評分=2.0分即clinical onset)及終末期組(采用snowG93A肢體評分法規(guī)定臨床評分=5.0分

5、即endstage),每組9只。
　　 2.標(biāo)本獲取對各組動(dòng)物同窩對照組、癥狀前期組、癥狀早期組(用snowG93A肢體評分法規(guī)定臨床評分=2.0分)及終末期組(采用snowG93A肢體評分法規(guī)定臨床評分=5.0分)分不同時(shí)期將動(dòng)物全身麻醉后迅速摘眼球放血并立即斷頭從椎管中取出脊髓,快速小心剝?nèi)ボ浖鼓ぜ凹股窠?jīng)節(jié)和神經(jīng)根,取腰膨大部位立即置液氮冷凍后迅速放置-80℃保存。
　　 3.IGFBP2和4的檢測應(yīng)用蛋白印跡法(w

6、estern blot)檢測各組腰膨大組織蛋白,應(yīng)用蛋白抽提試劑盒,嚴(yán)格按制造商說明書進(jìn)行提取組織總蛋白,再用BCA Protein Assay Kit測定蛋白濃度,根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果各組均取50μg樣本組織總蛋白經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠上電泳后,轉(zhuǎn)印蛋白至PVDF膜,5％脫脂奶粉封閉特異性抗原,分別加抗小鼠IGFBP-2單克隆抗體,抗兔IGFBP-4多克隆抗體,放置搖床4℃過夜,次日先TPBS洗3次,每

7、次10分鐘,用IRDye(R)800-conjugated羊抗兔二抗和IRDye(R)700-conjugated羊抗小鼠二抗室溫下?lián)u床避光,TPBS及PBS洗膜后Odyssey紅外掃膜儀掃描顯影。
　　 4.結(jié)果在SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠腰膨大組織中胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白2在癥狀早期組和終末期組相對密度值(0.28667±0.13和0.44667±0.16)較同窩對照組和癥狀前期組(0.16000±0.04和0.1366