小膠質(zhì)細(xì)胞在SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠腰髓及運(yùn)動(dòng)皮層中的變化.pdf

1、目的:肌萎縮側(cè)索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一種致死性神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病,表現(xiàn)為進(jìn)行性肌肉萎縮、肌無(wú)力和錐體束征?；颊叨嘣谑状纬霈F(xiàn)癥狀后的3-5年內(nèi)因球麻痹、呼吸衰竭或肺部感染而死亡。病理上以選擇性上或/和下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元丟失為特征,伴有小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞活化。約5-10％為家族性ALS(familial ALS,fALS),90-95％是散發(fā)性ALS(sporadic ALS,sALS)

2、。fALS和sALS的臨床表現(xiàn)很相似,大約20％fALS病例及4％sALS病例與銅鋅超氧化物歧化酶(Cu/Znsuperoxide dismutase1,SOD1)有關(guān),其中以G93A位點(diǎn)突變最常見(jiàn),即在基因密碼子第93位點(diǎn)甘氨酸代替丙氨酸。SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)為進(jìn)行性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性,與人類(lèi)ALS相似,是世界上研究ALS的公認(rèn)動(dòng)物模型。
　　 用人SOD1(human SOD,hSOD1)轉(zhuǎn)基因鼠進(jìn)行體內(nèi)和體外研究,

3、發(fā)現(xiàn)人突變SOD1(human mutant SOD1,hmSOD1)通過(guò)以下途徑使運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元受損,包括:異常蛋白質(zhì)聚集、線(xiàn)粒體功能失調(diào)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞骨架異常、軸漿運(yùn)輸受損、谷氨酸興奮毒性、生長(zhǎng)因子缺乏及神經(jīng)炎癥等。
　　 神經(jīng)炎癥是指一種細(xì)胞和分子過(guò)程,包括小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化及周?chē)庖呒?xì)胞的浸潤(rùn),在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)的多種病理?xiàng)l件下會(huì)發(fā)生,包括神經(jīng)變性疾病如ALS

4、等。神經(jīng)炎癥是ALS病人及hmSOD1模型小鼠的病理學(xué)特征,而神經(jīng)膠質(zhì)增生是神經(jīng)變性疾病中神經(jīng)炎癥的共同特點(diǎn)。在A(yíng)LS神經(jīng)炎癥部位,主要有星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞及少量的T-淋巴細(xì)胞。大量證據(jù)表明,炎癥在A(yíng)LS中起關(guān)鍵作用,然而小膠質(zhì)細(xì)胞-神經(jīng)元相互作用導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病的本質(zhì)仍然不明。目前廣泛研究的是小膠質(zhì)細(xì)胞慢性、有害的神經(jīng)炎癥引起神經(jīng)元變性。
　　 本實(shí)驗(yàn)用世界上廣泛研究的ALS動(dòng)物模型SOD1-G93A小鼠作為研究對(duì)象,應(yīng)

5、用免疫組織化學(xué)及激光共聚焦方法研究轉(zhuǎn)基因小鼠疾病不同時(shí)期運(yùn)動(dòng)皮層及腰髓小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量變化,應(yīng)用免疫印跡法研究小膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記物隨病程的表達(dá)變化,探討小膠質(zhì)細(xì)胞在SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠疾病進(jìn)程中的變化規(guī)律,分析其運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元死亡中的可能作用,為ALS治療提供潛在靶點(diǎn)。
　　 方法:
　　 1：轉(zhuǎn)基因鼠的繁殖所有轉(zhuǎn)基因鼠均飼養(yǎng)在恒溫(25-27℃)、恒濕、無(wú)特定病原菌(specificpathogen free

6、,SPF)環(huán)境中,以滅菌的SPF級(jí)顆粒型鼠類(lèi)飼料、無(wú)菌水進(jìn)行喂養(yǎng),每個(gè)鼠籠隨機(jī)飼養(yǎng)3-5只小鼠。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過(guò)程遵守河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理辦法規(guī)定。為維持B6SJL-TgN(SOD1-G93A)1 Gur轉(zhuǎn)基因小鼠突變基因穩(wěn)定下傳,將B6SJL SOD1-G93A/+半合子雄鼠與B6SJLF1/J雌鼠交配繁殖,兩種小鼠均購(gòu)自美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室(Bar Harbor,ME,USA),最初由Gurney等研制。子代鼠尾部組織在三周左右經(jīng)PCR

7、基因擴(kuò)增鑒定,確定是否帶有hSOD1基因。
　　 2：運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分及實(shí)驗(yàn)分組；
　　 2.1：運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分從小鼠50天開(kāi)始每天評(píng)分一次。采用4分評(píng)分系統(tǒng)。
　　 (1)4分正常,無(wú)運(yùn)動(dòng)障礙;
　　 (2)3分懸尾時(shí)后肢震顫;
　　 (3)2分步態(tài)異常;
　　 (4)1分至少一側(cè)后肢拖拽;
　　 (5)0分將小鼠仰或側(cè)臥,30秒內(nèi)不能翻正。
　　 2.2：實(shí)驗(yàn)分組

8、依據(jù)SOD1-G93A小鼠的發(fā)病規(guī)律分為癥狀前期(60天)、癥狀早期(100-120天)和終末期(130-150天)3個(gè)時(shí)間點(diǎn)取材。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)有模型組、同窩對(duì)照組。模型組為SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠,對(duì)照組為非轉(zhuǎn)基因同窩對(duì)照小鼠,每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只小鼠,均為雌性。癥狀前期組取自出生后60天,體重?zé)o減輕且無(wú)臨床癥狀,評(píng)分4分。癥狀期指體重開(kāi)始減輕、出現(xiàn)步態(tài)異常,評(píng)分2分。終末期以SOD1-G93A小鼠體重減輕＞20％,仰臥30秒不能翻

9、身為準(zhǔn),評(píng)分0分。
　　 3實(shí)驗(yàn)方法：
　　 3.1：取材：
　　 實(shí)驗(yàn)期間每天觀(guān)察動(dòng)物、評(píng)分及稱(chēng)重。在SOD1-G93A小鼠癥狀前期(60天)、癥狀早期(100-120天)和終末期(130-150天)時(shí)取材,同窩對(duì)照小鼠在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取材。用10％的水合氯醛(350mg/Kg)腹膜內(nèi)注射麻醉后,分別以4％多聚甲醛灌流固定保存或新鮮取腰髓或運(yùn)動(dòng)皮層組織迅速投入液氮速凍后于-80℃冰箱保存。
　　 3.2：免

10、疫印跡(Western blotting)分別取10mg腰髓及運(yùn)動(dòng)皮層組織按試劑盒說(shuō)明提取總蛋白,BCA法測(cè)蛋白濃度。每個(gè)樣品按30μg蛋白上樣,10％SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜,室溫脫脂奶粉(PBS稀釋)封閉1小時(shí)后,分別加兔抗CD11b抗體(1:200)、鼠抗GAPDH抗體(1:200)及羊抗SOD1抗體(1:200),4℃搖床過(guò)夜。次日,TPBS洗膜5次,每次5分鐘。然后分別加入抗兔、抗小鼠和抗羊熒光二抗(1:3000

11、)室溫孵育1小時(shí),TPBS洗膜4次,PBS洗膜1次,每次均為5分鐘,Odyssey紅外掃描成像系統(tǒng)(美國(guó)LI-COR公司)掃膜并分析結(jié)果。計(jì)算目的條帶與GAPDH的灰度比值并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
　　 3.3：免疫組織化學(xué)法脊髓及運(yùn)動(dòng)皮層組織經(jīng)4％多聚甲醛固定后,Leica VT1000S振動(dòng)切片機(jī)切成20μm切片,0.01M PBS溶液漂洗5分鐘×3次;3％H2O2浸泡15分鐘以封閉組織內(nèi)源性過(guò)氧化物酶;0.01M PBS漂洗5分

12、鐘×3次后,0.3％tritonX-100穿孔15分鐘。10％馬血清室溫封閉1小時(shí)后,加入兔抗Iba1抗體(1:200)4℃過(guò)夜;0.01M PBS洗5分鐘×3次后,加生物素化二抗(山羊抗兔IgG)室溫2小時(shí);0.01M PBS洗5分鐘×3次;加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素室溫1小時(shí);0.01M PBS洗5分鐘×3次,DAB染色10分鐘,撈片,脫水,透明及封片。
　　 3.4：共聚焦顯微鏡法腰髓組織經(jīng)4％多聚甲醛固定后,繼而用

13、30％蔗糖/4％多聚甲醛溶液浸泡12小時(shí)至組織沉底,以保護(hù)組織免受冰凍損傷。冷凍包埋劑OCT包埋后,經(jīng)Leica CM1850冷凍并切成30μm切片,與免疫組化方法相似,經(jīng)漂洗、穿孔、封閉及抗Iba1抗體孵育后,FITC標(biāo)記羊抗兔二抗室溫孵育1小時(shí),PBS漂洗后,抗熒光衰減封片劑封片,Olympus FV1000觀(guān)察及攝影。
　　 3.5：小膠質(zhì)細(xì)胞計(jì)數(shù)采用Nikon50i科研級(jí)顯微鏡。每個(gè)時(shí)期3只小鼠,每只小鼠隨機(jī)取5個(gè)視野,

14、400×放大倍數(shù)下分別計(jì)數(shù)SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠癥狀前期、癥狀早期及終末期腰髓前角及運(yùn)動(dòng)皮層有完整胞體的Iba1陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目,并與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ招∈笙啾容^。
　　 3.6：統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用SPSS13.0.4軟件,統(tǒng)計(jì)方法為多樣本參數(shù)方差分析。P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1：轉(zhuǎn)基因鼠的鑒定
　　 子代鼠基因組DNA的PCR產(chǎn)物電泳顯示:位于300-4

15、00bp之間的條帶(324bp),為內(nèi)參照IL-2的PCR產(chǎn)物;位于200-300bp之間的條帶(236bp),為人SOD1基因的PCR產(chǎn)物。
　　 2：臨床表現(xiàn)
　　 在60天及以前,SOD1-G93A小鼠無(wú)明顯臨床變化,評(píng)分4分。80-90天左右,懸尾實(shí)驗(yàn)時(shí)小鼠開(kāi)始出現(xiàn)雙后肢震顫,評(píng)分3分。在100-120天左右SOD1-G93A小鼠逐漸出現(xiàn)一側(cè)或雙側(cè)后肢明顯無(wú)力、肌肉萎縮及步態(tài)異常,評(píng)分2分。之后,雙后肢進(jìn)行性肌肉

16、萎縮,不能支撐身體,進(jìn)而至少一側(cè)后肢完全癱瘓,行走時(shí)拖拽,評(píng)分1分。約在130-150天左右,將其仰臥后30秒內(nèi)小鼠不能自行翻轉(zhuǎn),體重下降超過(guò)20％,達(dá)到終末期,評(píng)分0分。而同窩對(duì)照組小鼠無(wú)上述表現(xiàn),評(píng)分始終為4分。
　　 3：小膠質(zhì)細(xì)胞變化
　　 3.1：通過(guò)免疫印記法觀(guān)察小膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記物CD11b表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)同窩對(duì)照組小鼠腰髓表達(dá)量很少,且在60天至150天之間,隨年齡增長(zhǎng)其表達(dá)無(wú)明顯差異(P＞0.05)。在S

17、OD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠腰髓,癥狀前期表達(dá)即有所增多,癥狀早期明顯升高,終末期達(dá)高峰(P＜0.05)。而在SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠運(yùn)動(dòng)皮層,CD11b表達(dá)與同窩對(duì)照組相比無(wú)顯著差別(P＞0.05)。
　　 3.2：通過(guò)小膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記物Iba1免疫組化染色,發(fā)現(xiàn)同窩對(duì)照組腰髓前角Iba1陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目較少,胞體小且突起少,且在150天齡之前,隨年齡變化其數(shù)量無(wú)明顯差異。在SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠癥狀前期,Iba

18、1陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目輕度增多,癥狀早期明顯增多,胞體增大,突起增粗,終末期更著。而在癥狀早期及終末期的脊髓后角,Iba1陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目也存在輕度增生,但程度遠(yuǎn)不及前角。在運(yùn)動(dòng)皮層,SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠與同窩對(duì)照組相比Iba1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目無(wú)明顯差別。
　　 結(jié)論:
　　 SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠疾病進(jìn)展過(guò)程中存在小膠質(zhì)細(xì)胞增生,且早在癥狀前期已經(jīng)發(fā)生,癥狀早期增生顯著,終末期達(dá)高峰。小膠質(zhì)細(xì)胞增生的部位與疾