利用內(nèi)含子增強(qiáng)效應(yīng)提高Bt cry1Ah基因在轉(zhuǎn)基因玉米中的表達(dá).pdf

1、提高Btcry基因在轉(zhuǎn)基因作物中的表達(dá)水平是抗蟲轉(zhuǎn)基因研究的重要方面。大約80％-85％的植物基因含有內(nèi)含子，內(nèi)含子介導(dǎo)的增強(qiáng)效應(yīng)是提高外源基因在轉(zhuǎn)基因作物中表達(dá)水平的重要策略之一，但內(nèi)含子增強(qiáng)效應(yīng)的作用機(jī)理還不完全清楚，對(duì)其機(jī)理的研究有助于將內(nèi)含子介導(dǎo)的增強(qiáng)效應(yīng)與提高外源基因的表達(dá)水平有機(jī)的聯(lián)系起來，可以為內(nèi)含子在轉(zhuǎn)基因作物中的應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 本研究首先克隆了植物中4種不同基因中的內(nèi)含子，分別是來自玉米泛素蛋白基因的

2、第一內(nèi)含子(ubi1)、水稻肌動(dòng)蛋白基因的第一內(nèi)含子(act1)、玉米乙醇脫氫酶基因的第一內(nèi)含子(adh1)、馬鈴薯高賴氨酸基因SBgLR基因的第二內(nèi)含子(SBgLR2)。構(gòu)建瞬時(shí)表達(dá)載體后，基因槍轟擊玉米愈傷組織。對(duì)報(bào)告基因GUS進(jìn)行了組織化學(xué)分析和熒光定量分析。結(jié)果表明，ubi1增強(qiáng)基因表達(dá)活性的能力最強(qiáng)，它的存在可使GUS的表達(dá)活性提高到原來的5倍，act1可使GUS的表達(dá)活性提高到原來的3倍，adh1和SBgLR2沒有增強(qiáng)GUS

3、基因的表達(dá)活性。 分別選取了GUS基因編碼區(qū)的SnaBI(+385)，MscI(+622)，SspI(+1269)3個(gè)平端限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，將上步驟篩選得到的ubi1兩端引入平端酶切位點(diǎn)后，以平端片段形式插入。GUS熒光定量分析結(jié)果表明：當(dāng)使用CaMV35S啟動(dòng)子，基因的表達(dá)活性分別降低了36％，38％和40％。當(dāng)5'-UTR和+385位同時(shí)插入2個(gè)拷貝ubi1時(shí)，沒有得到5'-UTR單獨(dú)插入ubi1時(shí)的增強(qiáng)效應(yīng)，GUS基因

4、的表達(dá)活性降低了38％。當(dāng)3'-UTR插入ubi1時(shí)，GUS基因的表達(dá)活性降低了14％。RT-PCR分析結(jié)果表明+622，+1269位的ubi1可以被正確的剪接，+385位單獨(dú)插入ubi1時(shí)，正確剪輯位點(diǎn)旁的隱秘剪接位點(diǎn)被激活，導(dǎo)致了移碼突變。Real-timePCR分析結(jié)果表明當(dāng)ubi1平端插入到GUS基因編碼區(qū)時(shí)，基因的mRNA累積量明顯降低。 為保證內(nèi)含子插入到基因編碼區(qū)時(shí)不引入任何的外顯子序列，并且使內(nèi)含子插入后的剪接位

5、點(diǎn)序列與植物保守剪接位點(diǎn)序列完全相同，將ubi1以另外一種形式插入。對(duì)GUS基因的+13，+115，+513位分別進(jìn)行了定點(diǎn)突變以產(chǎn)生PstI內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，將ubi1以PstI片段形式插入到GUS基因的編碼區(qū)。GUS的熒光定量分析結(jié)果表明：ubi1位于+13位時(shí)，可使GUS的表達(dá)活性提高了4.26倍。當(dāng)ubi1分別位于GUS基因的+115、+513位時(shí)，GUS的表達(dá)活性分別提高了3.2倍和0.97倍。當(dāng)5'-UTR和+13位同時(shí)插入2

6、個(gè)拷貝的ubi1時(shí)，基因的表達(dá)活性為原來的1.55倍。RT-PCR分析結(jié)果表明+13，+115，+513位的內(nèi)含子均可以被正確的剪接。 根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，構(gòu)建了兩個(gè)含有Btcry1Ah基因的植物表達(dá)載體，在其中一個(gè)表達(dá)載體(pUUOAH)的5'-UTR處插入了ubi1。利用基因槍法將其導(dǎo)入玉米(ZeamaysL.)胚性愈傷組織中，得到了可育的再生植株。PCR、Southernblot檢測(cè)結(jié)果表明cry1Ah基因已整合入玉米基因組