谷氨酰胺誘導(dǎo)熱休克蛋白減輕大鼠腎臟缺血再灌注損傷.pdf

1、目的： 腎臟缺血再灌注損傷在臨床上很常見(jiàn)。減輕和避免腎缺血再灌注損傷在臨床上有重要意義。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)以下三個(gè)方面來(lái)研究谷氨酰胺對(duì)大鼠腎臟缺血再灌注的保護(hù)作用。為臨床上用藥提供參考。 1.觀察大鼠應(yīng)用谷氨酰胺后體內(nèi)血藥濃度的變化以論證谷氨酰胺的最佳作用劑量和時(shí)間。 2.通過(guò)應(yīng)用谷氨酰胺(Gln)后并設(shè)立對(duì)照組，利用病理切片和免疫組化的方法觀察大鼠腎臟缺血再灌注損傷的變化和大鼠腎臟小管細(xì)胞凋亡的變化。觀察谷氨酰胺是否減

2、輕大鼠腎臟缺血再灌注損傷。 3.通過(guò)應(yīng)用熱休克蛋白阻滯劑櫟黃皮桐(Quercetin)并設(shè)立對(duì)照組，探討谷氨酰胺減輕大鼠腎臟缺血再灌注損傷與誘導(dǎo)大鼠腎臟熱休克蛋白產(chǎn)生的關(guān)系。論證其對(duì)大鼠腎缺血再灌注損傷的保護(hù)作用的機(jī)理。 方法： 1. 12只S-D大鼠，雌雄不限，隨機(jī)分為2組，每組6只，分別給予不同劑量谷氨酰胺(0.75g/kg和0.375g/kg)運(yùn)用液相法測(cè)量0，15，30，45，60，120分鐘大鼠體內(nèi)的血

3、藥濃度。 2. 48只S-D大鼠，雌雄不限，隨機(jī)分為4組，每組12只，分別不同的方法進(jìn)行干預(yù)： A組：谷氨酰胺(Gln)組。經(jīng)尾靜脈給與谷氨酰胺(Gln)0.75g/kg． B組：生理鹽水對(duì)照組。給予生理鹽水作為對(duì)照，劑量和推注速度不變。 C組：櫟黃皮桐(quercetin)組。提前六小時(shí)腹腔注射給予櫟黃皮桐(quercetin)一種熱休克蛋白阻滯劑，劑量400mg/kg。然后同A組方法給予谷氨酰胺。

4、 D組；櫟黃皮桐對(duì)照溶劑組。提前六小時(shí)腹腔注射對(duì)照溶劑。然后同A組方法給予谷氨酰胺。 A，B，C，D四組藥物干預(yù)后1小時(shí)內(nèi)建立大鼠腎臟缺血再灌注模型，分別于再灌注6小時(shí)，24小時(shí)處死動(dòng)物，抽血離心生化分析血肌酐和尿素氮，并取雙側(cè)腎臟標(biāo)本，HE染色光鏡下觀察腎臟損傷情況并計(jì)分統(tǒng)計(jì)腎小管損傷程度。免疫組化和Western-Blot觀察熱休克蛋白(HSP-70)的表達(dá)。Tunel法觀察腎臟細(xì)胞凋亡并統(tǒng)計(jì)凋亡指數(shù)。 結(jié)果：

5、 1.谷氨酰胺血藥濃度變化本實(shí)驗(yàn)測(cè)谷氨酰胺的血藥濃度變化：在應(yīng)用0.75g/kg的谷氨酰胺給大鼠尾靜脈注射后一小時(shí)內(nèi)血藥濃度為3-7mmol/l。一小時(shí)后血液中谷氨酰胺濃度下降于3mmol/l以下。而在應(yīng)用0.375g/kg的谷氨酰胺給大鼠尾靜脈注射時(shí)，血藥濃度達(dá)不到3 mmol/l。由于文獻(xiàn)報(bào)道谷氨酰胺誘導(dǎo)熱休克蛋白的最大有效濃度為3-7 mmol/l。故本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在大鼠靜注0.75g/kg的谷氨酰胺后一小時(shí)之內(nèi)的血藥濃度為誘導(dǎo)

6、熱休克蛋白的最大有效濃度。 2.腎缺血再灌注后兩時(shí)間點(diǎn)的肌酐，尿素氮變化： 各組實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明大鼠腎臟缺血再灌注24小時(shí)后肌酐和尿素氮顯著高于缺血再灌注6小時(shí)后(P<0.05)。A，D兩組運(yùn)用了谷氨酰胺干預(yù)后，肌酐，尿素氮與B組相比明顯下降(P<0.05)。而C組與其他三組相比肌酐，尿素氮明顯增高(P<0.05)。 3.腎缺血再灌注后兩時(shí)間點(diǎn)病理切片HE染色結(jié)果： 鏡下觀察可見(jiàn)A，D兩組損傷情況類(lèi)似，主要表

7、現(xiàn)為腎小管上皮細(xì)胞變扁平，刷狀緣脫落，組織輕微充血，有少量細(xì)胞壞死和脫落。B組表現(xiàn)為腎上管上皮壞死，細(xì)胞脫落，蛋白管型形成。組織有比較嚴(yán)重的充血。C組表現(xiàn)較多的。腎上管上皮壞死，細(xì)胞脫落，細(xì)胞管型形成。組織大面積充血。 Paller氏計(jì)分結(jié)果表明： A，D兩組與B組比較損傷明顯減輕(P<0.01)。C組損傷重于B組(P<0.01)證明應(yīng)用谷氨酰胺對(duì)腎臟缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，在應(yīng)用了熱休克蛋白阻滯劑(Ouercetin

8、)后這種保護(hù)作用消失，同時(shí)可能由于阻滯了缺血再灌注損傷本身誘導(dǎo)熱休克蛋白產(chǎn)生的作用。導(dǎo)致?lián)p傷進(jìn)一步加重。 A，D兩組組內(nèi)計(jì)分有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(6小時(shí)損傷重于24小時(shí))，而B(niǎo)，C組組內(nèi)沒(méi)有這種差異，表明B，C兩組隨著時(shí)間的延長(zhǎng)損傷沒(méi)有顯著差別(P>0.05)。 而A，D 兩組可能是由于谷氨酰胺誘導(dǎo)了大量熱休克蛋白的產(chǎn)生而起到了修復(fù)損傷的作用。隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，損傷漸漸減輕。(P<0.05)。 4.腎缺血再灌注后兩時(shí)

9、間點(diǎn)免疫組化熱休克蛋白染色結(jié)果： 鏡下見(jiàn)A，D兩組HSP-70呈強(qiáng)陽(yáng)性，呈棕褐色，細(xì)顆粒狀，彌漫分布于細(xì)胞漿。B組6小時(shí)組HSP-70呈弱陽(yáng)性，呈淡黃色，細(xì)顆粒狀，彌漫分布于細(xì)胞漿，24小時(shí)組HSP-70呈陽(yáng)性，呈棕黃色，細(xì)顆粒狀，彌漫分布于細(xì)胞漿，相對(duì)于A組表達(dá)弱，但相對(duì)于B組6小時(shí)表達(dá)明顯。C組棕黃色染色區(qū)域很少，幾乎沒(méi)有表達(dá)。 熱休克蛋白染色鏡下評(píng)分結(jié)果： 統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明A，D兩組與B組比較熱休克蛋白表達(dá)明顯

10、增強(qiáng)(P<0.01)，而C組與B組相比熱休克蛋白表達(dá)明顯減弱(P<0.01)。 A，C，D組組內(nèi)比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，證明熱休克蛋白在6小時(shí)和24小時(shí)表達(dá)量沒(méi)有時(shí)間上的差異。 而B(niǎo)組24小時(shí)的熱休克蛋白表達(dá)要高于6小時(shí)，證明正常大鼠。腎臟缺血再灌注后熱休克蛋白的表達(dá)似乎24小時(shí)要比6小時(shí)有所增強(qiáng)。 5.腎缺血再灌注后兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)Westen—blot檢測(cè)結(jié)果：6小時(shí)A，D兩組表達(dá)最強(qiáng)，B組表達(dá)弱于A，D組，強(qiáng)于C組。

11、24小時(shí)A，D兩組表達(dá)最強(qiáng)，B組弱于A，D組，強(qiáng)于C組。 熱休克蛋白表達(dá)兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)結(jié)果一致，和免疫組化結(jié)果也一致。由于不是同一時(shí)間下電泳，因此無(wú)法比較同一組的組內(nèi)差異。 6.Tunel法觀察細(xì)胞凋亡結(jié)果： 鏡下觀察所見(jiàn)： A，D兩組見(jiàn)散在凋亡細(xì)胞。C組凋亡細(xì)胞數(shù)量多見(jiàn)。B組凋亡細(xì)胞可見(jiàn)。數(shù)量多于A，D組，少于C組。 凋亡指數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果： A，D兩組與B組相比凋亡指數(shù)明顯降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

12、<0.01)。C組與B組相比凋亡指數(shù)明顯升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。A，D兩組相比沒(méi)有差異(P>0.05)。A，B，C，D四組凋亡指數(shù)組內(nèi)比較沒(méi)有差異。(P>0.05)。這一結(jié)果說(shuō)明谷氨酰胺誘導(dǎo)熱休克蛋白可以減輕細(xì)胞凋亡。而應(yīng)用Quercetin阻滯熱休克蛋白產(chǎn)生后，這種抑制細(xì)胞凋亡的作用消失，而且由于抑制了細(xì)胞本身缺血再灌注后正常熱休克蛋白的產(chǎn)生，導(dǎo)致抑制凋亡的作用進(jìn)一步下降。細(xì)胞凋亡加重。 結(jié)論： 本實(shí)驗(yàn)研究

13、得出相關(guān)結(jié)論如下： 1.本實(shí)驗(yàn)測(cè)得的谷氨酰胺的血藥濃度與文獻(xiàn)研究結(jié)果是一致的，大鼠在應(yīng)用0.75g/kg的谷氨酰胺尾靜脈注射后一小時(shí)內(nèi)血藥濃度為3-7mmol/1。此為誘導(dǎo)大鼠器官熱休克蛋白表達(dá)的最佳有效濃度。一小時(shí)后谷氨酰胺血藥濃度下降，達(dá)不到誘導(dǎo)大鼠器官熱休克蛋白表達(dá)的最佳有效濃度。同樣應(yīng)用0.375g/kg的谷氨酰胺靜注后的血藥濃度也達(dá)不到最佳有效濃度。 2.在大鼠腎缺血再灌注前一個(gè)小時(shí)內(nèi)應(yīng)用谷氨酰胺證明對(duì)腎臟功能

14、有保護(hù)作用。肌酐，尿素值測(cè)定，HE染色下觀察和記分統(tǒng)計(jì)，Tunel法檢測(cè)細(xì)胞凋亡等實(shí)驗(yàn)證據(jù)都支持應(yīng)用谷氨酰胺后損傷減輕。 3.經(jīng)過(guò)免疫組化和Westen-blot的方法實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明在谷氨酰胺組腎臟損傷減輕的同時(shí)腎臟大量表達(dá)熱休克蛋白即Hsp-70。 4.通過(guò)設(shè)立Quercetin組即C組為對(duì)照，表明谷氨酰胺的這種對(duì)大鼠腎臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用主要是誘導(dǎo)了腎臟產(chǎn)生大量的熱休克蛋白，即Hsp-70。這種保護(hù)作用是通過(guò)熱休

15、克蛋白來(lái)發(fā)揮作用。阻滯了熱休克蛋白即Hsp-70的產(chǎn)生，這種保護(hù)作用消失。 5.免疫組化染色鏡下觀察和計(jì)分統(tǒng)計(jì)結(jié)果都發(fā)現(xiàn)大鼠腎缺血再灌注后自身可以誘導(dǎo)熱休克蛋白，在24小時(shí)熱休克蛋白的表達(dá)要大于6小時(shí)，而應(yīng)用谷氨酰胺后這種時(shí)間上的差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明谷氨酰胺誘導(dǎo)熱休克蛋白的表達(dá)6小時(shí)已經(jīng)達(dá)到或接近最大量。 6.HE染色鏡下觀察和計(jì)分統(tǒng)計(jì)，應(yīng)用谷氨酰胺組的24小時(shí)的損傷情況要輕于6小時(shí)。而對(duì)照組則沒(méi)有明顯的損傷差異。由