谷氨酰胺誘導心肌細胞熱休克蛋白表達信號轉導通路研究.pdf

1、目的：本文研究谷氨酰胺（Gln）誘導熱休克蛋白70（HSPT0）表達對脂多糖（LPS）刺激乳鼠心肌細胞的保護作用及0位-N-乙酰葡萄糖胺（O-GlcNAc）修飾在Gln誘導HSP70表達機制中的作用。 方法：原代培養(yǎng)SD乳鼠心肌細胞，實驗分六組：對照組（control，C組）給予雙蒸水；Gln組給予Gln5mM；LPS組給予4μg/ml內毒素（LPS）；Gln+LPS組給予Gln5mM+LPS4μg/ml；GLA組給予Gln5m

2、M+LPS4μg/ml+Alloxan1mM（Alloxan，四氧嘧啶，為0位-N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶OGT抑制劑，能阻止OGT催化N-乙酰氨基葡萄糖胺（GlcNAc）與蛋白質絲氨酸、蘇氨酸側鏈羥基連接，減少O-GlcNhc修飾水平）；GLP組給予Gln5mM+LPS4μg/ml+PUGNAc100μM（PUGNAc，朋那克，為0位-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶OGA抑制劑，能阻止OGA將GlcNAc從蛋向質側鏈羥基上移除，增加O-GlcN

3、Ac修飾水平）。干預后6h，以臺盼藍拒染法測定細胞生存率；比色法測定細胞培養(yǎng)液LDH活力以反映心肌細胞損傷情況；Western Blotting分析心肌細胞HSP70蛋白水平、胞核熱休克因子-1（HSF-1）蛋白水平和O-GlcNAc修飾水平；電泳遷徙率變動實驗（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）測定心肌細胞核HSF-1轉錄活性。計量資料以均值±標準差（x±s）表示，組間數(shù)據(jù)采用單因素方

4、差分析，以P<0．05有統(tǒng)計學意義。 結果：干預后6h各組細胞生存率差異無統(tǒng)計學意義（P>0．05）。與C組相比，給予LPS后細胞損傷增加（P<0．05），同時給予Gln和LPS能減輕心肌細胞損傷（P<0．05），此保護作用與HSP70的含量有關。Gln能增加LPS刺激心肌細胞HSPT0蛋白水平、胞核HSF-1蛋白水平及轉錄活性（P<0．05）。給予Gln后能增加LPS刺激心肌細胞O-GlcNAc修飾水平（P<0．05），此時心

5、肌細胞O-GlcNAc修飾水平與HSP70蛋白水平變化趨勢一致。為了進一步證實O-GlcNAc修飾與HSP70的關系，實驗使用Alloxan和PUGNAc對心肌細胞O-GlcNAc修飾水平進行干預，在此基礎上觀察HSP70蛋白水平、胞核HSF-1蛋白水平及轉錄活性變化情況。給予Alloxan能減少心肌細胞O-GlcNAc修飾水平，減少胞核HSF-1蛋白水平及轉錄活性，減少HSP70蛋白水平，增加心肌細胞損傷（P<0．05）；給予PUGN

6、Ac能增加心肌細胞O-GlcNAc修飾水平，增加胞核HSF-1蛋白水平及轉錄活性，增加HSP70蛋白水平（P<0．05）。 結論：LPS刺激乳鼠心肌細胞HSP70蛋白水平與胞核HSF-1蛋白水平及轉錄活性相關。O-GlcNAc修飾能作為感受器感知細胞外界環(huán)境變化并調節(jié)轉錄因子HSF-1的水平及轉錄活性。LPS刺激乳鼠心肌細胞給予Gln治療，可通過增加O-GlcNAc修飾水平，增加核內轉錄因子HSF-1水平及轉錄活性，進而促進HS