凝血酶促人肺成纖維細(xì)胞增殖及其機(jī)制的研究.pdf_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、背景:各種急慢性呼吸系統(tǒng)疾病常存在病原體感染、內(nèi)毒素產(chǎn)生、炎性介質(zhì)和炎性因子釋放、缺氧、缺血、酸中毒等諸多因素中的一種或多種,這些因素可導(dǎo)致血管內(nèi)皮受損和組織因子釋放,激活各種凝血因子,使血液呈高凝狀態(tài)或(和)血栓形成。凝血酶是參與此過(guò)程中的重要凝血因子之一。已有研究資料證實(shí),除發(fā)揮凝血功能外,凝血酶還具有重要的非凝血功能,即通過(guò)與細(xì)胞膜表面的蛋白酶激活受體-1(PAR1)結(jié)合,激活一系列下游信號(hào)通路,在細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分泌,粘附等方

2、面發(fā)揮重要作用。在急性肺損傷和各種慢性肺部疾病如慢性阻塞性肺病(COPD)、肺間質(zhì)性疾病中,肺泡灌洗液中的凝血酶濃度顯著升高,其與PAR1結(jié)合,產(chǎn)生各種病理生理作用,如促進(jìn)各類(lèi)炎癥因子IL-6、IL-8、PGE2、GM-CSF的釋放,調(diào)控肺部的炎癥反應(yīng)及修復(fù)增殖。另有研究表明凝血酶可通過(guò)激活NADPH氧化酶亞單位p47(phox)和p67(phox)誘導(dǎo)多種細(xì)胞如血管平滑肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、海馬神經(jīng)元細(xì)胞等產(chǎn)生以活性氧(ROS)為主的

3、自由基。ROS對(duì)細(xì)胞的作用具有兩面性,一方面,高濃度下具有損傷作用,參與促進(jìn)細(xì)胞的凋亡、壞死過(guò)程;另一方面,低濃度可作為重要的信號(hào)分子,參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),主要激活MAPK通路,通過(guò)激活轉(zhuǎn)錄因子,影響基因的表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化等。核因子NF-κ B是重要的轉(zhuǎn)錄因子之一,在氧化應(yīng)激、感染、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡及異常增殖等病理過(guò)程中,因調(diào)節(jié)多種靶基因的表達(dá)而發(fā)揮重要作用。肺成纖維細(xì)胞是肺組織重要結(jié)構(gòu)細(xì)胞,占肺間質(zhì)全部常駐細(xì)胞的95%以上,也

4、是參與肺損傷修復(fù)的主要細(xì)胞。在損傷后的修復(fù)過(guò)程中,成纖維細(xì)胞表現(xiàn)出極高增殖反應(yīng)。各種損害因子導(dǎo)致肺部毛細(xì)血管通透性增加,血漿成分滲漏到毛細(xì)血管外并與肺成纖維細(xì)胞接觸,刺激該細(xì)胞的增殖修復(fù)反應(yīng)。推測(cè)凝血酶可能在其中發(fā)揮一定作用。
   目的:凝血酶作用于肺成纖維細(xì)胞,檢測(cè)細(xì)胞產(chǎn)生ROS情況及產(chǎn)生途徑,觀察ROS是否可以活化MAPK信號(hào)系統(tǒng),進(jìn)而影響核轉(zhuǎn)錄因子NF-κ B,調(diào)控生長(zhǎng)基因的表達(dá)。
   方法:選擇人肺成纖維細(xì)胞

5、(HLF)作為體外研究對(duì)象,一定濃度的凝血酶作用于該細(xì)胞。MTT法和流式細(xì)胞Brdu摻入法檢測(cè)凝血酶促人肺成纖維細(xì)胞增殖現(xiàn)象;利用化學(xué)熒光法、流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)和GSH檢測(cè)試劑盒檢測(cè)活性氧的產(chǎn)生;Western blot法檢測(cè)PAR1,NADPH氧化酶、ERK1/2及p38MAPK信號(hào)蛋白的表達(dá);激光共聚焦顯微掃描技術(shù)觀察NF-κ B中亞單位p65向核內(nèi)轉(zhuǎn)移情況。
   結(jié)果:⑴在0.1U/ml-20U/ml濃度范圍內(nèi),凝血酶對(duì)細(xì)

6、胞的增殖能力隨濃度遞增而增強(qiáng)。在10 U/ml及以上時(shí),與對(duì)照組比較,可顯著促進(jìn)HLF細(xì)胞的增殖(P<0.05),但當(dāng)濃度超過(guò)20U/ml,增殖作用不再增強(qiáng);20 U/ml的凝血酶分別作用HLF24 h、36 h、48 h、60 h、72 h,從36h時(shí)間點(diǎn)開(kāi)始,與對(duì)照組比較,凝血酶組細(xì)胞增殖能力顯著增強(qiáng)(P<0.05);BrdU摻入增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,凝血酶濃度在10 U/ml及以上時(shí),較對(duì)照組可顯著促進(jìn)HLF細(xì)胞增殖(P<0.05),

7、并隨濃度增加而增強(qiáng),但當(dāng)凝血酶濃度超過(guò)20U/ml,增殖作用不再更強(qiáng)。⑵5U/ml及以上濃度的凝血酶可顯著增加HLF內(nèi)的活性氧數(shù)量(P<0.05),并呈劑量依賴(lài)關(guān)系,但當(dāng)濃度大于20U/ml,活性氧的量不再增加;20U/ml凝血酶作用HLF細(xì)胞30min,流式檢測(cè)顯示細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生量較對(duì)照組增加64.7%,作用1h時(shí)細(xì)胞內(nèi)ROS量較對(duì)照組增加138.8%,而加入凝血酶拮抗劑水蛭素組細(xì)胞內(nèi)ROS量與對(duì)照組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.

8、05);10U/ml和20 U/ml的凝血酶作用HLF細(xì)胞,細(xì)胞內(nèi)GSH/GSSG比值較對(duì)照組顯著降低(P<0.05),而加入水蛭素或氧自由基拮抗劑NAC組,GSH/GSSG之比與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。⑶20 U/ml凝血酶作用于HLF細(xì)胞10min和30min,胞漿內(nèi)NADPH氧化酶亞單位p47phox和Rac2表達(dá)顯著降低(P<0.05),1h后幾乎無(wú)蛋白表達(dá)。加入水蛭素組與對(duì)照組比較,p47phox和Rac2表達(dá)無(wú)統(tǒng)

9、計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。⑷凝血酶作用于HLF細(xì)胞10min到2h,細(xì)胞內(nèi)磷酸化ERK1/2表達(dá)水平較對(duì)照組顯著升高(P<0.05),而提前加入NAC或水蛭素組則無(wú)表達(dá);細(xì)胞內(nèi)p38MAPK磷酸化不受凝血酶影響,即凝血酶作用HLF細(xì)胞10min到2h,蛋白磷酸化水平較對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。⑸凝血酶分別作用HLF細(xì)胞5min、10min、30min、1h和2h,各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞核內(nèi)代表p65的熒光含量與對(duì)照組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意

10、義(P>0.05),而佛波酯組熒光含量明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。⑹支氣管上皮細(xì)胞和肺成纖維細(xì)胞均有PAR1蛋白表達(dá),肺成纖維細(xì)胞受體表達(dá)更明顯(P<0.05)。
   結(jié)論:①凝血酶具有促進(jìn)人肺成纖維細(xì)胞HLF增殖的能力。②凝血酶促進(jìn)HLF細(xì)胞增殖機(jī)制包括如下。③凝血酶受體PAR1在HLF中有較高表達(dá)。④凝血酶通過(guò)與PAR1受體結(jié)合,激活NADPH氧化酶,誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生活性氧。⑤凝血酶通過(guò)磷酸化ERK1/2而不是

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