抗-CTGF單鏈抗體的制備及其在抑制肺纖維化形成中的作用.pdf

1、背景：結締組織生長因子（Connective tissue growth factor，CTGF）作為轉化生長因子（Transforming growth factor beta，TGF-β）的下游效應因子，可以介導細胞遷移、侵襲、血管發(fā)生和細胞凋亡，促使膠原及纖維連接蛋白等細胞外基質的產生和沉積，可能是最終導致組織器官纖維化的關鍵因子；肺纖維化是嚴重威脅人類健康的致死性肺間質疾病，以肺間質中間質細胞的異常增殖、彌漫性或局限性成纖維細胞

2、灶的存在為主要病理特征，目前對肺纖維化的傳統(tǒng)治療對改善病人生存率或阻止病程進展缺乏明確的依據。
　　 目的：獲得具有生物學活性的抗-CTGF單鏈抗體（single-chain variable fragment ofantibody，scFv）純品；研究其在抑制肺纖維化形成和發(fā)展中的作用；探索其對肺成纖維細胞表型轉化的影響以及可能的信號通路，初步闡明其作用機制。
　　 方法：1.將pET32a-trxA-scFv-His

3、質粒轉化E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細胞，IPTG誘導表達融合蛋白，用NTA Resin親和層析初步純化后用凝血酶酶切，Sephadex-G50凝膠過濾層析再次純化，用SDS/PAGE方法鑒定純度；以雙夾心ELISA方法檢測抗體的免疫活性；2.通過氣管內注射博萊霉素建立小鼠肺纖維化模型，尾靜脈注射抗-CTGF scFv進行干預。將實驗動物分為四組：NS+NS組（氣管內與尾靜脈均注射生理鹽水），NS+scFv組（氣管內注射生理鹽

4、水，尾靜脈注射抗-CTGF單鏈抗體），BLM+NS組（氣管內注射博萊霉素，尾靜脈注射生理鹽水），BLM+scFv組（氣管內注射博萊霉素，尾靜脈注射抗-CTGF單鏈抗體），分別于7、14、28天時測定小鼠肺泡灌洗液細胞總數(shù)以及細胞分類計數(shù)、肺組織羥脯氨酸含量；肺組織石蠟切片HE染色與Masson染色觀察肺泡炎和肺纖維化程度；免疫組織化學染色法觀察肺中CTGF表達的部位及表達量；3.用CTGF刺激體外培養(yǎng)的人肺成纖維細胞，然后用抗-CTGF

5、 scFv干預，用Western blotting檢測α-SMA及磷酸化ERK1/2表達量的變化。
　　 結果：經過兩步層析純化后，抗-CTGF scFv純度達到90％以上，體外免疫學試驗顯示目的蛋白具有良好的CTGF結合活性。經抗-CTGF scFv處理后第7天、第14天，BLM+NS組和BLM+scFv組小鼠BALF中細胞總數(shù)及巨噬細胞、淋巴細胞明顯高于其它組（P<0.05），BLM+scFv組明顯低于BLM+NS組（P<0

6、.05），第28天時無差異顯著性（P>0.05）；肺病理切片HE和Masson染色顯示BLM+scFv組肺泡炎和纖維化程度降低；免疫組織化學染色結果顯示，BLM+scFv組與BLM+NS組相比，肺組織中CTGF的表達明顯減少；Western blotting結果顯示，人肺成纖維細胞用CTGF刺激后再以scFv干預后，α-SMA明顯低于CTGF組（P<0.05），磷酸化ERK1/2水平明顯低于CTGF組（P<0.05）。
　　 結