基于家系和單體型的TIM-1及TIM-3基因多態(tài)性與變應(yīng)性哮喘的關(guān)聯(lián)研究.pdf

1、變應(yīng)性哮喘是一種與免疫相關(guān)的復(fù)雜疾病，受遺傳和環(huán)境等多種因素的共同影響而發(fā)病。個(gè)體的遺傳因素在哮喘發(fā)病中起著十分重要的作用。應(yīng)用全基因組掃描或定位克隆技術(shù)已發(fā)現(xiàn)多個(gè)染色體區(qū)域與哮喘連鎖。其中以5q31-33 區(qū)最受研究者的關(guān)注，因?yàn)樵搮^(qū)域包含眾多細(xì)胞因子的基因以及一些與免疫相關(guān)的基因，且在多個(gè)人群的關(guān)聯(lián)研究中重復(fù)表現(xiàn)與哮喘高度的連鎖。越來(lái)越多的研究表明TH1/TH2細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子的失衡與哮喘的發(fā)病相關(guān)。最近研究顯示表達(dá)在T細(xì)胞表

2、面的Tims基因家族蛋白在調(diào)節(jié)TH1和TH2細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答中起重要的作用。在人類(lèi)，Tim-1和Tim-3是Tims基因家族重要的兩個(gè)成員，它們均位于與哮喘高度連鎖的染色體5q31-33區(qū)域。Tim-1主要表達(dá)在TH2細(xì)胞表面，調(diào)節(jié)TH2細(xì)胞的免疫應(yīng)答。而Tim-3主要表達(dá)在TH1細(xì)胞表面，對(duì)TH1細(xì)胞起負(fù)性免疫調(diào)節(jié)作用?；赥im-1和Tim-3在TH1/TH2免疫調(diào)節(jié)中重要的功能，Tim-1和Tim-3基因已成為哮喘重要的易感候選

3、基因。針對(duì)Tim-1和Tim-3多態(tài)性與哮喘的關(guān)聯(lián)研究雖已在多個(gè)人群中開(kāi)展，但受多種因素的影響，這些研究的結(jié)果未能得到統(tǒng)一和重復(fù)。對(duì)Tim-1與Tim-3基因多態(tài)性與哮喘的關(guān)系，仍需進(jìn)一步研究。本研究我們首先探討了Tim-1與Tim-3基因的表達(dá)與變應(yīng)性哮喘的關(guān)系，然后采用基于家系和單體型的關(guān)聯(lián)研究方法，應(yīng)用TDT和HRR檢驗(yàn)來(lái)分析Tim-1和Tim-3基因的多態(tài)性及單體型與中國(guó)湖北地區(qū)變應(yīng)性哮喘及相關(guān)表型的相關(guān)性。研究分為3個(gè)部分。<

4、br>　　 第一部分：Tim-1及Tim-3在變應(yīng)性哮喘患者PBMC中的表達(dá)
　　 目的：探討Tim-1和Tim-3mRNA 在變應(yīng)性哮喘患者外周血單個(gè)核細(xì)胞的表達(dá)水平，為進(jìn)一步闡明Tims基因與哮喘的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：隨機(jī)收集的塵螨過(guò)敏性哮喘患者，共計(jì)12例，哮喘診斷全部符合2003年中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸學(xué)分會(huì)哮喘學(xué)組制定的標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)選取性別和年齡匹配的健康體檢者12例作為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)分3組，分別為哮喘組，塵螨刺激

5、組和正常對(duì)照組。Ficoll 分離PBMC后，取24孔培養(yǎng)板，哮喘組和塵螨刺激組每孔分別加入106個(gè)病人分離的PBMC，正常對(duì)照組加入106個(gè)健康體檢者的PBMC，對(duì)塵螨刺激組再加入終濃度為20 μg/m1的塵螨抗原。然后置37 ℃ 5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，收集細(xì)胞，抽提總RNA。參照文獻(xiàn)Tim-1、Tim-3引物序列，合成引物，采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)3組Tim-1和Tim-3的mRNA表達(dá)。
　　 結(jié)果：

6、1. Tim-1 mRNA 在塵螨過(guò)敏性哮喘患者外周血PBMC中相對(duì)表達(dá)值為0.27±0.09，顯著高于健康對(duì)照組的0.13±0.03（P<0.05）；患者PBMC 在終濃度為20μg/m1的塵螨抗原刺激后，Tim-1表達(dá)明顯升高，達(dá)0.59±0.22，與對(duì)照組和未刺激的哮喘組相比有顯著差異（P<0.01）；2. Tim-3mRNA 在哮喘患者外周血PBMC中相對(duì)表達(dá)值為0.39±0.09，明顯高于健康對(duì)照組的0.18±0.06，差異有

7、顯著性（P<0.05），同樣患者PBMC 在塵螨抗原刺激后，Tim-3 mRNA的表達(dá)也出現(xiàn)明顯的升高，達(dá)0.66±0.22，與對(duì)照組和未刺激組相比差異均有顯著性（P<0.01）。
　　 結(jié)論：Tim-1和Tim-3mRNA 在塵螨變應(yīng)性哮喘患者中表達(dá)明顯升高，Tim-1和Tim-3可能參與人類(lèi)變應(yīng)性哮喘的發(fā)生和發(fā)展。
　　 第二部分：Tim-3基因多態(tài)性及其與變應(yīng)性哮喘易感性的關(guān)系
　　 第一節(jié)：Tim-3基因

8、序列的測(cè)定及其多態(tài)性的確定
　　 目的：探討湖北地區(qū)漢族人群Tim-3基因啟動(dòng)子區(qū)和編碼區(qū)的多態(tài)性及其構(gòu)成的單體型特征，為后續(xù)基于Tim-3基因多態(tài)性與相關(guān)疾病的關(guān)聯(lián)研究奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：選取湖北地區(qū)30例正常漢族人和30例變應(yīng)性哮喘患者作為研究對(duì)象。采用分段PCR 擴(kuò)增直接測(cè)序法檢測(cè)這60名研究對(duì)象Tim-3基因的啟動(dòng)子區(qū)、全部的外顯子區(qū)及部分內(nèi)含子區(qū)的多態(tài)性變異。將測(cè)序結(jié)果與NCBI 及HapMap數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)

9、比，確定湖北漢族人群Tim-3基因多態(tài)性的分布特征。采用Pearson χ2檢驗(yàn)或Fisher's 確切概率法比較各位點(diǎn)的基因型和等位基因的頻率在哮喘組和正常人組的分布。采用Haploview軟件對(duì)各位點(diǎn)進(jìn)行LD 分析、單體型的構(gòu)建和tSNPs的篩選。
　　 結(jié)果：1. Tim-3基因區(qū)域共檢出13個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，其中有5個(gè)為新發(fā)現(xiàn)的位點(diǎn)。各位點(diǎn)基因型和等位基因頻率在30例正常組和30例哮喘組中未見(jiàn)明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。

10、2. 經(jīng)與HapMap數(shù)據(jù)庫(kù)比較，4個(gè)位點(diǎn)rs4704853、rs10515746、rs4704846、rs9313439等位基因的頻率在湖北漢族人和北方漢族及日本人中的分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而與歐洲人及非洲人的分布有明顯的不同（P<0.01）。3.對(duì)7個(gè)頻率大于5%的SNPs 進(jìn)行兩兩配對(duì)的LD 分析顯示其中6個(gè)位點(diǎn)之間呈現(xiàn)較強(qiáng)的連鎖不平衡（D′和r2 均大于0.3）。單體型分析共發(fā)現(xiàn)有5種頻率大于1%的常見(jiàn)單體型。4

11、. 在該單體型域中選出3個(gè)tSNPs：rs10053538、rs13170556和rs9313441 用來(lái)代表該區(qū)域常見(jiàn)多態(tài)性變異。
　　 結(jié)論：湖北漢族人群Tim-3基因的SNPs分布有別于其他人種，基于這些SNPs 構(gòu)建的單體型和篩選出的tSNPs為研究湖北漢族人群Tim-3基因多態(tài)性與相關(guān)疾病的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。
　　 第二節(jié)：基于家系的Tim-3基因多態(tài)性與變應(yīng)性哮喘的關(guān)聯(lián)研究
　　 目的：探討Tim-3基

12、因的多態(tài)性及其單體型與湖北地區(qū)漢族人群變應(yīng)性哮喘及相關(guān)表型的關(guān)系。
　　 方法：收集湖北地區(qū)118個(gè)完整的由一名患者及其雙親組成的變應(yīng)性哮喘核心家系，共354名成員，均為漢族。應(yīng)用PCR-RFLP方法，對(duì)118個(gè)核心家系Tim-3基因3個(gè)標(biāo)簽SNPs，rs10053538、rs13170556和rs9313441及1個(gè)啟動(dòng)子區(qū)的多態(tài)性rs10515746 進(jìn)行基因分型；采用基于單體型-標(biāo)簽SNP和家系資料的關(guān)聯(lián)檢驗(yàn)的方法（TDT

13、，HRR，F(xiàn)BAT），分析Tim-3基因的多態(tài)性及其單體型與湖北地區(qū)漢族人群變應(yīng)性哮喘及相關(guān)表型的關(guān)系。
　　 結(jié)果：1. Tim-3基因的4個(gè)SNPs單個(gè)位點(diǎn)TDT和HRR 分析結(jié)果顯示，Tim-3基因的這4個(gè)多態(tài)性與湖北漢族人變應(yīng)性哮喘之間不存在連鎖不平衡關(guān)系，P＞0.05。2. 應(yīng)用TRANSMIT軟件進(jìn)行單體型的TDT 分析結(jié)果顯示，Tim-3基因的單體型與變應(yīng)性哮喘有關(guān)聯(lián)，Global χ2檢驗(yàn)，χ2=10.83，P=

14、0.013。單個(gè)單體型TDT結(jié)果顯示，父母?jìng)鬟f給患病子女G-G-G單體型的觀察值小于期望值，差異有顯著性（χ2=8.24，P=0.004）。單體型HRR 分析顯示G-G-G，具有較低的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(HRR=0.49)。3. FBAT分析結(jié)果顯示Tim-3基因的多態(tài)性及單體性與哮喘數(shù)量表型血清總IgE 水平無(wú)關(guān)聯(lián)。
　　 結(jié)論：Tim-3基因區(qū)域的多態(tài)性以單體型的形式影響哮喘的易感性，Tim-3基因本身或其附近的染色體區(qū)域內(nèi)可能存在與

15、變應(yīng)性哮喘易感性相關(guān)的位點(diǎn)。單體型G-G-G可能作為用來(lái)對(duì)湖北漢族人群哮喘易感性進(jìn)行預(yù)測(cè)為標(biāo)志。
　　 第三部分:基于家系的Tim-1基因多態(tài)性與變應(yīng)性哮喘易感性關(guān)系
　　 目的：探討Tim-1基因的多態(tài)性及其單體型與湖北地區(qū)漢族人群變應(yīng)性哮喘及哮喘相關(guān)表型的關(guān)系。
　　 方法：收集湖北地區(qū)118個(gè)完整的由一名患者及其雙親組成的變應(yīng)性哮喘核心家系，共354名成員，均為漢族。應(yīng)用PCR —RFLP方法，對(duì)118個(gè)核

16、心家系Tim-1基因3個(gè)標(biāo)簽SNPs（rs4704842、rs953569、rs2134230）和1個(gè)位于啟動(dòng)子區(qū)的多態(tài)位點(diǎn)-232 G>A以及1個(gè)位于外顯子4區(qū)多態(tài)位點(diǎn) rs45623443 進(jìn)行基因分型；采用基于單體型-標(biāo)簽SNPs和家系資料的關(guān)聯(lián)檢驗(yàn)的方法（TDT，HRR;，F(xiàn)BAT），檢測(cè)Tim-1基因的多態(tài)性及其單體型與湖北地區(qū)漢族人群變應(yīng)性哮喘及哮喘相關(guān)表型的關(guān)系。
　　 結(jié)果：1. Tim-1基因的5個(gè)SNPs單個(gè)

17、位點(diǎn)TDT和HRR 分析結(jié)果顯示均與哮喘無(wú)關(guān)聯(lián)，P>0.05。2.單體型的TDT和HRR 分析發(fā)現(xiàn)Tim-1基因區(qū)域的G-A-ins-C-G單體型與變應(yīng)性哮喘有關(guān)聯(lián)，P<0.05。該單體型由父母?jìng)鬟f給患病子女的觀察值高于期望值，是變應(yīng)性哮喘發(fā)病的一個(gè)風(fēng)險(xiǎn)因素，HRR=1.91。3. FBAT分析結(jié)果顯示Tim-1基因rs45623443 多態(tài)性位點(diǎn)Ins等位基因與哮喘表型血清總IgE 水平相關(guān)，P<0.05；4. Tim-1單體型的FB