重組日本七鰓鰻rLj—RGD3與其突變體蛋白類HRG的抗血管新生與抗真菌活性.pdf

1、Lj-RGD3為七鰓鰻口腔腺中發(fā)現(xiàn)的RGD毒素蛋白，含有三個(gè)RGD模體序列，且與富含組氨酸糖蛋白(HRG)有一定序列同源性。本課題旨在探討Lj-RGD3類HRG的抑制血管新生功能和抑菌功能。為了研究其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，本文對(duì)野生型Lj-RGD3進(jìn)行了RGD及組氨酸His的缺失突變，合成了六種突變體，包括:缺失全部His，并缺失或者保留三個(gè)RGD的Lj-26和Lj-27;保留全部His，缺失三個(gè)RGD的Lj-112，以及分別只保留第1位，

2、第2位和第3位RGD的Lj-113，Lj-114和Lj-115。將這六種突變基因全序列合成后，構(gòu)建于載體pET-23b中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)可溶性蛋白，然后經(jīng)組氨酸親和層析進(jìn)行純化。
　　抗血管新生功能實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果:用MTT法檢測細(xì)胞增殖，結(jié)果顯示，rLj-RGD3的六種突變體蛋白均能在一定程度上抑制堿性成纖維生長因子(bFGF)誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的增殖，并且呈劑量依賴性。用雞絨毛尿囊膜（CAM）模型研究這七種蛋

3、白的體內(nèi)抗血管新生功能，結(jié)果顯示，用等量的蛋白去處理雞胚，除rLj-26外，rLj-RGD3與其他五種突變體蛋白均能抑制雞胚的血管新生，其中rLj-112和rLj-27的作用更加明顯。抗血管新生分子共同的特點(diǎn)就是它們能夠抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和浸潤。本文用Transwel板檢測各蛋白對(duì)bFGF誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞遷移和浸潤的抑制作用，浸潤實(shí)驗(yàn)中，在Transwell板中包被人工基底膜基質(zhì)Matrigel來模仿體內(nèi)環(huán)境。結(jié)果顯示，除rLj-2

4、6外，rLj-RGD3與其他五種突變體蛋白均能抑制HUVEC細(xì)胞的遷移和浸潤，其中rLj-112和rLj-27的抑制率較高。因此可以得出結(jié)論:除rLj-26，野生型rLj-RGD3與其他五種突變體蛋白均具有抑制血管新生功能，且突變體Lj-112和Lj-27都表現(xiàn)出了較野生型和其他突變體蛋白較高的活性。這表明，rLj-112為類HRG蛋白，可能參與生長因子信號(hào)通路而抑制血管新生;而rLj-27是RGD毒素蛋白，是以整合素信號(hào)通路行使抗血管

5、新生功能的;同時(shí)存在RGD模體和類HRG結(jié)構(gòu)并沒有使野生型Lj-RGD3的抗血管新生功能得到增強(qiáng);只含有一個(gè)RGD的突變體蛋白Lj-113、Lj-114及Lj-115的抑制血管新生功能均強(qiáng)于野生型rLj-RGD3，說明三個(gè)RGD模體間的抗血管新生功能也不是相互疊加的。
　　抑菌功能實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果:采用牛津杯法檢測rLj-RGD3及其突變體蛋白的抑菌活性，首先選取革蘭氏陰性菌大腸桿菌，革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌和真菌白念珠菌作為試驗(yàn)

6、菌，結(jié)果顯示，野生型rLj-RGD3與其他突變體蛋白均有一定的抑制真菌活性，但沒有抑制細(xì)菌活性。相較于其他蛋白，突變體rLj-112的抑菌圈最大，且rLj-112抑制白念珠菌的活性是呈劑量依賴性的。采用逐級(jí)稀釋法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，來檢測rLj-112對(duì)白念珠菌最小抑菌濃度(MIC)及抑制率。結(jié)果測得野生型rLj-RGD3的MIC值為42μM，rLj-112的MIC值為7.7μM，陽性對(duì)照酮康唑(ketoconazole)的MIC值為15μM

7、。接著采用平板菌落計(jì)數(shù)法測定了rLj-112的殺菌動(dòng)力學(xué)(Time-kill)曲線，結(jié)果顯示，1×MIC和2×MIC的rLj-112在分別作用12h和6h后，能夠使白念珠菌的生長減少98％以上，而0.5×MIC的rLj-112在作用24h后，依然不能明顯的抑制白念珠菌。為了觀察rLj-RGD3及其突變體處理后白色念珠菌膜的形態(tài)，將白念珠菌與各蛋白30℃孵育后，用掃描電鏡觀察，結(jié)果顯示，與對(duì)照組PBS相比，rLj-112處理過的白念珠菌在