重組人可溶性突變體BAFF蛋白的制備及生物學(xué)活性研究.pdf

1、B細(xì)胞活化因子(B cell activating factor belonging to the TNF family, BAFF)是腫瘤壞死因子配體家族的新成員，是調(diào)節(jié)B細(xì)胞免疫的重要細(xì)胞因子；在體內(nèi)，它以膜結(jié)合型和可溶型兩種活性形式存在，可溶性蛋白由152個(gè)氨基酸(134～285)組成，是膜結(jié)合型的BAFF在體內(nèi)蛋白酶的作用下水解釋放得到的胞外區(qū)片段，也是其發(fā)揮功能的主要區(qū)域。BAFF作為一種B淋巴細(xì)胞共刺激因子，能夠促進(jìn)B細(xì)胞增

2、殖、活化、分化及抗體的產(chǎn)生，延長B細(xì)胞的存活；在BAFF轉(zhuǎn)基因鼠，出現(xiàn)類似人系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic Lupus Erythematosus，SLE)和Sjogren's綜合征等自身免疫病的表現(xiàn)；BAFF過表達(dá)也在SLE、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid Arthritis，RA）、Sjogren's綜合征和一些B細(xì)胞腫瘤患者中發(fā)現(xiàn)。因此，BAFF作為一種重要的免疫調(diào)節(jié)分子，在維持B細(xì)胞動態(tài)平衡中發(fā)揮關(guān)鍵作用；BAFF的異常

3、表達(dá)在B細(xì)胞惡性增殖性疾病和異?；罨约膊≈邪l(fā)揮重要的致病作用。BAFF可與BAFF-R、TACI和BCMA三個(gè)受體特異性結(jié)合而發(fā)揮其生物學(xué)作用，其中BAFF-R是其特異受體，只能與BAFF結(jié)合，BAFF-R與BAFF之間的親和力遠(yuǎn)大于其它兩個(gè)受體。另外，研究發(fā)現(xiàn)，BAFF的受體不僅在正常B細(xì)胞上表達(dá)，而且在淋巴瘤和自身免疫病等惡性B細(xì)胞和異常增殖的B細(xì)胞有較高水平的表達(dá)。BAFF受體表達(dá)的細(xì)胞特異性，提示BAFF及其受體可作為B細(xì)胞惡

4、性增殖性疾病和異?；罨约膊〉闹匾臐撛谥委煱悬c(diǎn)。
　　 目的：
　　 鑒于BAFF及其受體有望成為治療相關(guān)性疾病的新靶點(diǎn)。為此我們根據(jù)編碼人sBAFF氨基酸的核苷酸序列，對其cDNA序列進(jìn)行人工突變，得到了可溶性突變體BAFF(soluble mutant BAFF,smBAFF)編碼序列，構(gòu)建了相應(yīng)重組表達(dá)質(zhì)粒，表達(dá)、純化了重組人smBAFF(recombinant human smBAFF,rh-smBAFF)。通

5、過rh-smBAFF與BAFF競爭性結(jié)合BAFF受體的初步研究，探討其作為BAFF拮抗劑治療B細(xì)胞淋巴瘤和系統(tǒng)性紅斑狼瘡等B細(xì)胞異常增生活化性疾病的可行性。
　　 方法：
　　 1.rh-smBAFF基因合成和克?。焊鶕?jù)BAFF蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能域分析和大腸桿菌密碼子偏性，合成人smBAFF基因并克隆至pUC57獲得重組載體pUC57-smBAFF。依據(jù)smBAFF基因序列設(shè)計(jì)包含NdeI和XhoI位點(diǎn)的特異性引物，經(jīng)PC

6、R擴(kuò)增得到目的基因片段，將目的基因片段插入到pMD19-T克隆載體，構(gòu)建重組克隆質(zhì)粒pMD19-T/smBAFF。行菌落PCR篩選及酶切鑒定陽性克隆，對目的基因片段進(jìn)行DNA序列測定。
　　 2.表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定：純化重組克隆質(zhì)粒pMD19-T/smBAFF，經(jīng)NdeI和XhoI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳分離并純化smBAFF基因片段，將其插入到經(jīng)相應(yīng)酶切的表達(dá)載體pQE-T7-2上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，菌落PCR鑒定陽性重組

7、表達(dá)質(zhì)粒。
　　 3.rh-smBAFF的表達(dá)鑒定：重組質(zhì)粒pQE-T7-2/smBAFF轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)菌株，挑取單克隆菌落擴(kuò)增至對數(shù)生長期，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，SDS-PAGE分析和Western blot鑒定重組蛋白。
　　 4.rh-smBAFF表達(dá)形式的鑒定：大量誘導(dǎo)表達(dá)rh-smBAFF，分別收集細(xì)菌裂解上清和包涵體沉淀，行SDS-PAGE分析蛋白表達(dá)形式。
　　 5.rh-smBAFF純化：在變性條

8、件下采用Ni2+-NTA親和層析法對目的蛋白進(jìn)行純化，行SDS-PAGE分析目的蛋白純度，變性的目的蛋白經(jīng)尿素濃度逐漸降低透析液透析復(fù)性，超濾濃縮目的蛋白。
　　 6.受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)：用免疫熒光技術(shù)檢測rh-smBAFF與B淋巴細(xì)胞結(jié)合能力。
　　 7.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：用CCK-8法檢測rh-smBAFF對sBAFF促B細(xì)胞增殖的競爭抑制作用。
　　 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 結(jié)果：

9、
　　 1.rh-smBAFF表達(dá)載體、菌株的構(gòu)建：優(yōu)化的人smBAFF基因序列經(jīng)序列分析與預(yù)期一致。插入原核表達(dá)載體pQE-T7-2，構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pQE-T7-2/smBAFF。原核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)、SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示誘導(dǎo)后的重組菌株在17KDa處出現(xiàn)明顯蛋白條帶，與目的蛋白的大小相同，經(jīng)凝膠圖像掃描分析顯示目的蛋白約占菌體總蛋白的40％。Western blot結(jié)果顯示重組蛋白與

10、抗人BAFF多克隆抗體和抗His-Tag多克隆抗體均能發(fā)生特異性反應(yīng)，表明獲得的重組蛋白為特異性smBAFF蛋白。
　　 2.rh-smBAFF的分離純化：重組菌株擴(kuò)增、IPTG誘導(dǎo)，分離細(xì)菌裂解上清和包涵體，經(jīng)SDS-PAGE分析顯示，重組蛋白主要位于包涵體中。變性裂解包涵體，經(jīng)Ni2+-NTA親和層析法純化目的蛋白，行SDS-PAGE和凝膠圖像掃描分析，smBAFF蛋白純度達(dá)90%以上。
　　 3.rh-smBAFF

11、特異性結(jié)合B細(xì)胞：細(xì)胞免疫熒光顯示，重組smBAFF蛋白能與B細(xì)胞表面受體有特異性結(jié)合能力。
　　 4.rh-smBAFF對sBAFF促B細(xì)胞增殖的抑制作用：經(jīng)CCK-8法檢測顯示，th-smBAFF失去刺激B細(xì)胞增殖的作用，且能抑制sBAFF對B細(xì)胞增殖的刺激作用。
　　 結(jié)論：
　　 成功構(gòu)建了rh-smBAFF原核表達(dá)載體和高效穩(wěn)定表達(dá)工程菌株；純化的重組蛋白rh-smBAFF無B細(xì)胞增殖活性但保留了良好的