重組日本七鰓鰻rLj—RGD3與其KGD突變體的抗血管新生、抗血小板聚集活性比較.pdf

1、rLj-RGD3為來自七鰓鰻口腔唾液腺中含有三個RGD模體的RGD毒素蛋白，并且與組氨酸富含糖蛋白HRG具有序列同源性。RGD毒素蛋白及HRG都具有抑制血管新生的活性，但是由于作用靶點(diǎn)不同而涉及不同的信號通路。本文關(guān)注于rLj-RGD3及其KGD突變體蛋白抗血小板聚集和抗血管新生活性的比較研究。KGD模體具有與血小板細(xì)胞膜表面糖蛋白GPⅡb/Ⅲa專一性結(jié)合，而與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面高表達(dá)的整合素αvβ3不結(jié)合的特點(diǎn)，因此含有KGD模體的蛋白

2、具有專一性抗血小板聚集而對血管新生無抑制作用的特性，從而有利于開發(fā)出專一性抗血栓新藥。通過對野生型rLj-RGD3進(jìn)行RGD模體替換為KGD模體的突變，獲得了系列KGD模體突變蛋白，包括rLj-116、rLj-28和rLj-26。對上述突變體蛋白的純化物進(jìn)行了抗血管新生和抗血小板聚集活性的研究。采用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV304為體外血管新生模型對其抗血管新生活性進(jìn)行了比較研究:MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示rLj-RGD3和rLj-116抑

3、制ECV304細(xì)胞增殖的IC50分別為0.562μmol/l和0.832μmol/l，rLj-26和rLj-28均沒有明顯抑制作用;細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)表明rLj-RGD3和rLj-116均具有劑量依賴性誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡的作用，而rLj-26和rLj-28不能誘導(dǎo)ECV304發(fā)生凋亡;采用Transwell細(xì)胞培養(yǎng)板檢測各蛋白對bFGF誘導(dǎo)ECV304細(xì)胞遷移的抑制作用，結(jié)果顯示rLj-RGD3和rLj-116對ECV304細(xì)胞遷移的抑制作用顯

4、著，而rLj-28作用差異不明顯， rLj-26無抑制作用。利用人工基質(zhì)膜基質(zhì)Matrigel及Transwell模仿體內(nèi)環(huán)境，研究rLj-RGD3與三種突變體蛋白對ECV304細(xì)胞浸潤的抑制作用，結(jié)果顯示rLj-RGD3和rLj-116均明顯抑制以bFGF為趨化劑的ECV304細(xì)胞穿透Matrigel的浸潤行為，而rLj-28作用不明顯，rLj-26無抑制作用;以雞胚絨毛尿囊膜(chickenchorioallantoic membr

5、ane，CAM)作為體內(nèi)血管新生模型，測定了各蛋白對體內(nèi)血管新生的抑制作用，結(jié)果表明rLj-116和rLj-RGD3對CAM的血管新生具有明顯的抑制作用，其余實(shí)驗(yàn)組均無顯著效果;采用兔的富血小板血漿(platelet-richplasma，PRP)系統(tǒng)進(jìn)行血小板聚集測試，結(jié)果顯示rLj-RGD3和rLj-116的抗血小板聚集作用比較顯著，呈劑量依賴關(guān)系，且rLj-116的抑制作用要遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于rLj-RGD3，其他實(shí)驗(yàn)組則均無明顯作用。由此