重組人可溶性BAFF及其突變體的制備與活性分析.pdf

1、TNF家族的B淋巴細(xì)胞活化因子(BAFF)是腫瘤壞死因子(TNF)超家族的一個新成員，它屬Ⅱ型跨膜蛋白，通過與其受體結(jié)合而廣泛參與B細(xì)胞增殖分化及抗體的產(chǎn)生；同時也參與T細(xì)胞的活化與應(yīng)答過程，在體液免疫和細(xì)胞免疫中具有重要作用。研究證實BAFF過表達(dá)密切參與了多種自身免疫性疾病和某些腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。因此，BAFF及其受體有望成為治療相關(guān)性疾病時進行藥物設(shè)計的新靶點。為此我們克隆了編碼人BAFF胞外區(qū)134-285氨基酸殘基(即可溶性B

2、AFF，sBAFF)及其突變體cDNA，構(gòu)建了相應(yīng)重組表達(dá)質(zhì)粒，表達(dá)并純化了sBAFF及其突變體蛋白，最后對sBAFF及其突變體蛋白的功能活性進行了鑒定。所取得的主要研究結(jié)果如下： 1.經(jīng)RT-PCR成功地克隆了sBAFFcDNA。測序后經(jīng)查對，與GenBank上登錄的編碼相應(yīng)sBAFFcDNA的序列完全一致。 2.以pUC19/sBAFF為模板，經(jīng)一步反向PCR構(gòu)建sBAFF的突變體cDNA，使BAFF217-224位

3、的八個氨基酸(VHVFGDEL)的編碼序列被GG，SS，SG和GS的編碼序列所取代。 3.將測序正確的野生型和突變體目的片段插入原核表達(dá)質(zhì)粒pQE-80L，成功地構(gòu)建了重組原核表達(dá)質(zhì)粒pQE-80L/sBAFF，pQE-80L/GG，pQE-80L/SS，pQE-80L/SG及pQE-80L/GS。 4.上述質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，均獲得了較高水平的表達(dá)。SDS-PAGE和Westernblot分析

4、表明，重組sBAFF蛋白主要位于包涵體中，分子量約為20kDa；而四個突變體蛋白則在包涵體和胞漿中均有表達(dá)，且在胞漿中表達(dá)占優(yōu)勢，分子量約為19kDa。確立了目的蛋白在大腸桿菌中高效表達(dá)的最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件為終濃度0.5mmol/L的IPTG在37℃誘導(dǎo)表達(dá)4小時。 5.sBAFF蛋白經(jīng)Ni2+-NTA純化系統(tǒng)及尿素分步透析，得到了有效純化和復(fù)性，復(fù)性蛋白經(jīng)SephadexG75柱分析顯示，以單體和三聚體兩種形式存在。四個突變體蛋

5、白在天然狀態(tài)下經(jīng)Ni2+-NTA純化系統(tǒng)和PBS透析后也得到了有效純化。純化蛋白在SDS-PAGE上均呈現(xiàn)單一條帶。 6.生物學(xué)活性分析顯示，本實驗所制備的重組人sBAFF蛋白不僅可刺激人外周血淋巴細(xì)胞增殖，而且還能刺激非何杰金氏淋巴瘤細(xì)胞Raji的增殖。同時還證實四個突變體蛋白對sBAFF野生型蛋白刺激細(xì)胞增殖功能均有抑制作用。 功能性重組人sBAFF及其突變體的制備，為進一步揭示BAFF的作用機制及研發(fā)基于BAFF突