中國(guó)龍蝦基因組文庫(kù)的構(gòu)建及微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選.pdf

1、本文通過(guò)構(gòu)建中國(guó)龍蝦(Panulirus stimpsoni)的小片段基因組文庫(kù)并運(yùn)用PCR法從中篩選含有中國(guó)龍蝦微衛(wèi)星序列的重組陽(yáng)性克隆。篩選的引物為pUC118載體兩端的通用引物M13+/-以及自行設(shè)計(jì)的核苷酸重復(fù)序列引物(CT)15和(AT)15，通過(guò)M13+/-與核苷酸重復(fù)序列引物(CT)15和(AT)15進(jìn)行組合配對(duì)，對(duì)中國(guó)龍蝦基因組文庫(kù)中的重組陽(yáng)性克隆進(jìn)行篩選。對(duì)經(jīng)過(guò)篩選后可能含有中國(guó)龍蝦微衛(wèi)星序列的重組陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，首

2、次得到了78個(gè)中國(guó)龍蝦微衛(wèi)星序列，分別分布于55個(gè)中國(guó)龍蝦重組陽(yáng)性克隆中。對(duì)78個(gè)中國(guó)龍蝦微衛(wèi)星序列進(jìn)行分類，其中perfect 50個(gè)，占64％；imperfect 3個(gè)，占3.8％；compound perfect 6個(gè)，占7.7％；compound imperfect 19個(gè)，占24.5％。這些微衛(wèi)星序列都已經(jīng)在Genbank中進(jìn)行了注冊(cè)。研究結(jié)果還表明，在中國(guó)龍蝦基因組DNA中，(CT)n、(AT)n形式的微衛(wèi)星序列的含量非常豐

3、富。從78個(gè)中國(guó)龍蝦微衛(wèi)星序列中選取了24個(gè)較好的微衛(wèi)星序列，運(yùn)用Primer5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)并委托上海生物工程有限公司合成24對(duì)微衛(wèi)星引物。經(jīng)過(guò)設(shè)置梯度退火溫度進(jìn)行PCR篩選，2％瓊脂糖電泳和8％聚丙烯酰胺電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，24對(duì)微衛(wèi)星引物中有20對(duì)能夠擴(kuò)增出產(chǎn)物，再經(jīng)過(guò)調(diào)節(jié)、優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，應(yīng)用8％聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，最終篩選出具有多態(tài)性的中國(guó)龍蝦微衛(wèi)星引物17對(duì)，其中合適進(jìn)行中國(guó)龍蝦微衛(wèi)星分析的引物有15對(duì)。在20個(gè)中

4、國(guó)龍蝦樣本中用具有多態(tài)性的微衛(wèi)星引物擴(kuò)增其基因組DNA，在15個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上，得到等位基因的數(shù)目為3到12個(gè)不等，等位基因的大小分布在78bp到425bp之間，基本符合引物設(shè)計(jì)的理論長(zhǎng)度。這些微衛(wèi)星位點(diǎn)的期望雜合度范圍為0.48到0.87，平均值為0.71，表明中國(guó)龍蝦基因組微衛(wèi)星具有較高的雜合度，中國(guó)龍蝦具有較高的遺傳多樣性。其中15個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的：PIC值從0.44到0.84，平均值為0.60，說(shuō)明這些微衛(wèi)星位點(diǎn)在中國(guó)龍蝦基因組中包