玉米ZmPOT基因TALEN敲除和過表達(dá)載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、容重是一個(gè)重要的產(chǎn)量性狀，也是作物超高產(chǎn)育種的重要目標(biāo)性狀。玉米容重能夠真實(shí)地反映玉米的成熟度、完整度、均勻度、籽粒結(jié)構(gòu)緊實(shí)度和使用價(jià)值，是玉米商品及加工品質(zhì)的重要指標(biāo)，是國(guó)際貿(mào)易中質(zhì)量定級(jí)的重要因素。長(zhǎng)期以來，對(duì)玉米品質(zhì)的研究大多集中在如何提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和加工品質(zhì)上，而忽略了商品品質(zhì)尤其是容重對(duì)玉米品質(zhì)的影響。對(duì)容重這個(gè)復(fù)雜性狀的遺傳基礎(chǔ)研究不夠深入，導(dǎo)致我國(guó)玉米容重改良進(jìn)展緩慢，嚴(yán)重影響了國(guó)際市場(chǎng)的競(jìng)爭(zhēng)力。課題組前期以容重為研究對(duì)象，

2、在玉米第7號(hào)染色體上定位到一個(gè)主效的QTL，該QTL區(qū)段內(nèi)存在一個(gè)重要的候選基因，命名為ZmPOT。功能預(yù)測(cè)表明該基因編碼POT家族蛋白，是氨基酸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。本研究構(gòu)建了帶有胚乳特異性啟動(dòng)子GT1的植物過表達(dá)載體pCUB-GT1-ZmPOT-bar以及TALEN敲除ZmPOT基因的載體。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行玉米幼胚和胚性愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化，以期建立玉米TALEN敲除體系，并利用過表達(dá)及敲除技術(shù)研究ZmPOT基因的功能。<

3、br>　　本研究取得如下結(jié)果:
　　1.以B73籽?？俁NA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，克隆了ZmPOT基因。所克隆的ZmPOT序列全長(zhǎng)為2084 bp，編碼640個(gè)氨基酸，擴(kuò)增的片段與Gramene數(shù)據(jù)庫(kù)公布的該基因序列相似性為100％。
　　2.用In-Fusion法將胚乳特異性啟動(dòng)子Gt1和目的基因分別連接到pCUB骨架載體上，構(gòu)建了植物表達(dá)載體pCUB-GT1-ZmPOT-bar。經(jīng)PCR檢測(cè)、酶切鑒定及表達(dá)載體的序列分

4、析表明，表達(dá)載體構(gòu)建成功。
　　3.為了保證TALEN敲除的特異性，我們?cè)谟衩譠mPOT基因的第二個(gè)外顯子上設(shè)計(jì)了TALEN左右臂靶點(diǎn)。利用質(zhì)粒文庫(kù)試劑盒，將TALEN質(zhì)粒模塊分別構(gòu)建到左右臂骨架載體上。
　　4.分別酶切左右臂骨架載體和pCAMBIA1301植物表達(dá)載體，再將TALEN左右臂模塊連接到pCAMBIA1301植物表達(dá)載體上，經(jīng)過酶切鑒定及模塊序列分析表明，表達(dá)載體構(gòu)建成功。
　　5.通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將p

5、CUB-GT1-ZmPOT-bar和TALEN敲除載體分別轉(zhuǎn)化玉米幼胚組織和玉米胚性愈傷組織。經(jīng)除草劑草甘膦和潮霉素篩選后得到具有抗性的轉(zhuǎn)基因植株，以幼胚為受體得到過表達(dá)載體的T0代抗性植株9株，以愈傷組織為受體得到的TALEN敲除載體T0代抗性植株146株。
　　6.根據(jù)啟動(dòng)子區(qū)設(shè)計(jì)特異引物，經(jīng)PCR檢測(cè)過表達(dá)載體抗性植株基因組DNA，未得到陽(yáng)性植株。TALEN敲除載體得到陽(yáng)性植株15株。
　　7.將TALEN敲除載體得到