CMV和ToMV嵌合基因反向重復(fù)植物表達(dá)載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、黃瓜花葉病毒（Cucumbermosaicvirus，CMV）和番茄花葉病毒（Tomatomosaicvirus,ToMV）是危害茄科植物的兩種主要病毒，常以復(fù)合侵染的方式對(duì)作物造成嚴(yán)重的危害，是造成新疆加工番茄壞死條斑病的重要因素。利用基因沉默原理，將病毒本身的一些基因轉(zhuǎn)化到植物基因組中，使之表達(dá)病毒來(lái)源的dsRNA，誘導(dǎo)RNA沉默獲得抗病毒植株是當(dāng)前抗病毒轉(zhuǎn)基因的主要途徑。本研究以嚴(yán)重危害新疆加工番茄的2種病毒CMV與ToMV為目標(biāo)

2、，將ToMV部分移動(dòng)蛋白基因(△MP)和CMV的部分復(fù)制相關(guān)蛋白基因（△Rep）進(jìn)行嵌合，構(gòu)建成能自我互補(bǔ)的發(fā)夾型RNA（hpRNA）結(jié)構(gòu)，以農(nóng)桿菌法轉(zhuǎn)化到煙草和加工番茄，希望獲得能夠同時(shí)抗CMV和ToMV的轉(zhuǎn)基因煙草和轉(zhuǎn)基因加工番茄。
　　1、CMV部分復(fù)制酶（△Rep）基因和ToMV的運(yùn)動(dòng)蛋白（△MP）基因的獲得
　　從田間采集表現(xiàn)壞死條斑癥狀和表現(xiàn)花葉及蕨葉癥狀的加工番茄病株，分別根據(jù)ToMVMP基因和CMVRep基因

3、序列分別設(shè)計(jì)特異性引物MP-F/MP-R和Rep-F/Rep-R，分別對(duì)病株進(jìn)行相應(yīng)目標(biāo)基因的RT-PCR、克隆和測(cè)序，結(jié)果獲得795bp和546bp核苷酸序列。基因庫(kù)檢索表明，它們分別為T(mén)oMVMP基因和部分CMVRep基因。
　　2、嵌合基因△MP-Rep反向重復(fù)植物表達(dá)載體的構(gòu)建
　　根據(jù)已測(cè)ToMVMP基因和CMVRep基因的序列設(shè)計(jì)特異性引物和中間引物，通過(guò)重組PCR技術(shù)將2個(gè)病毒基因進(jìn)行融合，獲得長(zhǎng)度為711bp

4、的融合基因△MP-Rep。將融合基因以反向重復(fù)的方式與大豆內(nèi)含子相連，得到含有融合基因反向重復(fù)序列的重組質(zhì)粒pBlueSK-Intron△MP-Rep(i/r)。再用限制性?xún)?nèi)切酶BamHI切下包含Intron在內(nèi)的反向重復(fù)的融合基因，并定向插入到植物表達(dá)載體pBIN438上，構(gòu)建了含兩種病毒基因的植物表達(dá)載體pBIN438△MP-Rep（i/r）。酶切和PCR鑒定證明所構(gòu)建的載體與預(yù)期的設(shè)計(jì)完全一致。
　　3、含△MP-Rep基因

5、的植物雙元重組表達(dá)載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化及抗性植株的再生
　　利用三親交配法將帶有△MP-Rep基因反向重復(fù)的植物表達(dá)載pBIN438△MP-Rep(i/r)轉(zhuǎn)入到根癌農(nóng)桿菌EHA105中，通過(guò)PCR和酶切鑒定陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化子用于煙草和加工番茄的轉(zhuǎn)化。經(jīng)卡那霉素與羧芐青霉素抗性篩選分別獲得轉(zhuǎn)融合基因△MP-Rep的再生煙草植株40株和加工番茄植株11株，所有植株的PCR檢測(cè)均為陽(yáng)性。本研究結(jié)果為利用RNA沉默原理進(jìn)行植物廣譜抗病研究奠定了基