CMV和ToMV嵌合基因反向重復植物表達載體的構建及遺傳轉化.pdf

1、黃瓜花葉病毒（Cucumbermosaicvirus，CMV）和番茄花葉病毒（Tomatomosaicvirus,ToMV）是危害茄科植物的兩種主要病毒，常以復合侵染的方式對作物造成嚴重的危害，是造成新疆加工番茄壞死條斑病的重要因素。利用基因沉默原理，將病毒本身的一些基因轉化到植物基因組中，使之表達病毒來源的dsRNA，誘導RNA沉默獲得抗病毒植株是當前抗病毒轉基因的主要途徑。本研究以嚴重危害新疆加工番茄的2種病毒CMV與ToMV為目標

2、，將ToMV部分移動蛋白基因(△MP)和CMV的部分復制相關蛋白基因（△Rep）進行嵌合，構建成能自我互補的發(fā)夾型RNA（hpRNA）結構，以農桿菌法轉化到煙草和加工番茄，希望獲得能夠同時抗CMV和ToMV的轉基因煙草和轉基因加工番茄。
　　1、CMV部分復制酶（△Rep）基因和ToMV的運動蛋白（△MP）基因的獲得
　　從田間采集表現(xiàn)壞死條斑癥狀和表現(xiàn)花葉及蕨葉癥狀的加工番茄病株，分別根據ToMVMP基因和CMVRep基因

3、序列分別設計特異性引物MP-F/MP-R和Rep-F/Rep-R，分別對病株進行相應目標基因的RT-PCR、克隆和測序，結果獲得795bp和546bp核苷酸序列?；驇鞕z索表明，它們分別為ToMVMP基因和部分CMVRep基因。
　　2、嵌合基因△MP-Rep反向重復植物表達載體的構建
　　根據已測ToMVMP基因和CMVRep基因的序列設計特異性引物和中間引物，通過重組PCR技術將2個病毒基因進行融合，獲得長度為711bp

4、的融合基因△MP-Rep。將融合基因以反向重復的方式與大豆內含子相連，得到含有融合基因反向重復序列的重組質粒pBlueSK-Intron△MP-Rep(i/r)。再用限制性內切酶BamHI切下包含Intron在內的反向重復的融合基因，并定向插入到植物表達載體pBIN438上，構建了含兩種病毒基因的植物表達載體pBIN438△MP-Rep（i/r）。酶切和PCR鑒定證明所構建的載體與預期的設計完全一致。
　　3、含△MP-Rep基因

5、的植物雙元重組表達載體的農桿菌轉化及抗性植株的再生
　　利用三親交配法將帶有△MP-Rep基因反向重復的植物表達載pBIN438△MP-Rep(i/r)轉入到根癌農桿菌EHA105中，通過PCR和酶切鑒定陽性的轉化子用于煙草和加工番茄的轉化。經卡那霉素與羧芐青霉素抗性篩選分別獲得轉融合基因△MP-Rep的再生煙草植株40株和加工番茄植株11株，所有植株的PCR檢測均為陽性。本研究結果為利用RNA沉默原理進行植物廣譜抗病研究奠定了基