CMV和ToMV嵌合基因反向重復植物表達載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、黃瓜花葉病毒（Cucumbermosaicvirus，CMV）和番茄花葉病毒（Tomatomosaicvirus,ToMV）是危害茄科植物的兩種主要病毒，常以復合侵染的方式對作物造成嚴重的危害，是造成新疆加工番茄壞死條斑病的重要因素。利用基因沉默原理，將病毒本身的一些基因轉(zhuǎn)化到植物基因組中，使之表達病毒來源的dsRNA，誘導RNA沉默獲得抗病毒植株是當前抗病毒轉(zhuǎn)基因的主要途徑。本研究以嚴重危害新疆加工番茄的2種病毒CMV與ToMV為目標

2、，將ToMV部分移動蛋白基因(△MP)和CMV的部分復制相關(guān)蛋白基因（△Rep）進行嵌合，構(gòu)建成能自我互補的發(fā)夾型RNA（hpRNA）結(jié)構(gòu)，以農(nóng)桿菌法轉(zhuǎn)化到煙草和加工番茄，希望獲得能夠同時抗CMV和ToMV的轉(zhuǎn)基因煙草和轉(zhuǎn)基因加工番茄。
　　1、CMV部分復制酶（△Rep）基因和ToMV的運動蛋白（△MP）基因的獲得
　　從田間采集表現(xiàn)壞死條斑癥狀和表現(xiàn)花葉及蕨葉癥狀的加工番茄病株，分別根據(jù)ToMVMP基因和CMVRep基因

3、序列分別設計特異性引物MP-F/MP-R和Rep-F/Rep-R，分別對病株進行相應目標基因的RT-PCR、克隆和測序，結(jié)果獲得795bp和546bp核苷酸序列?；驇鞕z索表明，它們分別為ToMVMP基因和部分CMVRep基因。
　　2、嵌合基因△MP-Rep反向重復植物表達載體的構(gòu)建
　　根據(jù)已測ToMVMP基因和CMVRep基因的序列設計特異性引物和中間引物，通過重組PCR技術(shù)將2個病毒基因進行融合，獲得長度為711bp

4、的融合基因△MP-Rep。將融合基因以反向重復的方式與大豆內(nèi)含子相連，得到含有融合基因反向重復序列的重組質(zhì)粒pBlueSK-Intron△MP-Rep(i/r)。再用限制性內(nèi)切酶BamHI切下包含Intron在內(nèi)的反向重復的融合基因，并定向插入到植物表達載體pBIN438上，構(gòu)建了含兩種病毒基因的植物表達載體pBIN438△MP-Rep（i/r）。酶切和PCR鑒定證明所構(gòu)建的載體與預期的設計完全一致。
　　3、含△MP-Rep基因

5、的植物雙元重組表達載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化及抗性植株的再生
　　利用三親交配法將帶有△MP-Rep基因反向重復的植物表達載pBIN438△MP-Rep(i/r)轉(zhuǎn)入到根癌農(nóng)桿菌EHA105中，通過PCR和酶切鑒定陽性的轉(zhuǎn)化子用于煙草和加工番茄的轉(zhuǎn)化。經(jīng)卡那霉素與羧芐青霉素抗性篩選分別獲得轉(zhuǎn)融合基因△MP-Rep的再生煙草植株40株和加工番茄植株11株，所有植株的PCR檢測均為陽性。本研究結(jié)果為利用RNA沉默原理進行植物廣譜抗病研究奠定了基