奶牛乳腺炎金黃色葡萄球菌基因工程蛋白的純化及其免疫原性研究.pdf

1、奶牛乳腺炎(Mastitis)是造成奶牛業(yè)經(jīng)濟(jì)損失的最主要原因之一，而且還給人類的健康帶來(lái)了潛在的危害。目前，引起奶牛乳腺炎的病原菌眾多，且治療時(shí)大量抗生素的使用不但使奶牛對(duì)病原菌產(chǎn)生抗性，而且抗生素的殘留問(wèn)題也日益影響著食品衛(wèi)生安全和人類健康。利用疫苗來(lái)預(yù)防和控制奶牛乳腺炎是一種安全、經(jīng)濟(jì)、有效的方法。兩年來(lái)，研究人員對(duì)山東省奶牛場(chǎng)臨床型乳腺炎的流行病學(xué)進(jìn)行了較為細(xì)致的研究，證實(shí)金黃色葡萄球菌是引起該地區(qū)奶牛乳腺炎的主要病原菌。本課題

2、針對(duì)引起奶牛乳腺炎的主要病原菌金黃色葡萄球菌α-溶血素和FnbpA黏附素基因工程蛋白進(jìn)行了分離純化及活性檢測(cè)，并制備了與其相對(duì)應(yīng)的基因工程亞單位疫苗。通過(guò)建立小自鼠試驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯?duì)疫苗的免疫效力進(jìn)行了評(píng)估。本研究分為四部分： 試驗(yàn)一不同純化方法得到的基因工程蛋白金黃色葡萄球菌α-溶血素的生物學(xué)特性比較 以在宿主菌株BL21(DE3)中成功表達(dá)的重組金黃色葡萄球菌α-溶血素蛋白作為研究對(duì)象，分析比較通過(guò)凝膠過(guò)濾層析(Gel Fi

3、ltrationChromatography)和鎳柱親和層析純化試劑盒(Ni-NTA Spin Columns)純化所得到的重組蛋白的蛋白含量和生物特性方面的差異。SDS-PAGE分析檢測(cè)純化產(chǎn)物，Bradford法測(cè)定蛋白含量，兔紅細(xì)胞測(cè)定半數(shù)溶血效價(jià)。結(jié)果顯示這兩種方法得到的純化產(chǎn)物在53 kD處均呈現(xiàn)單一清晰帶，達(dá)電泳級(jí)純度。與此同時(shí)，凝膠過(guò)濾對(duì)目的蛋白的純化率為14.04％，蛋白含量為0.337 mg/mL，溶血活性為1519H

4、U/mg；鎳柱親和層析的純化率為17.5％，蛋白含量為0.35 mg/mL，溶血活性為1463HU/mg。由此可見(jiàn)，凝膠過(guò)濾得到的純化產(chǎn)物在蛋白含量和蛋白活性方面絲毫不亞于鎳柱親和層析純化試劑盒，而且減少了實(shí)驗(yàn)室經(jīng)費(fèi)支出。 試驗(yàn)二金黃色葡萄球菌α-溶血素和FnbpA黏附素基因工程蛋白的分離純化及活性檢測(cè) 金黃色葡萄球菌毒素基因流行情況的調(diào)查報(bào)道顯示，金黃色葡萄球菌分泌的α-溶血素和凝固酶能協(xié)同作用引發(fā)小鼠乳腺炎。其分泌的

5、黏附素能識(shí)別細(xì)胞表面組分并與之結(jié)合，促使細(xì)菌粘附到細(xì)胞表面，從而定居和繁殖。這兩種毒素在金黃色葡萄球菌感染及致病的過(guò)程中具有重要作用。本試驗(yàn)將成功表達(dá)的α-溶血素和黏附素蛋白從表達(dá)宿主菌株中通過(guò)凝膠過(guò)濾層析法分離純化出來(lái)并檢測(cè)其生物學(xué)活性。 試驗(yàn)三奶牛乳腺炎金黃色葡萄球菌α-溶血素基因工程疫苗的制備及實(shí)驗(yàn)室免疫效力評(píng)價(jià) 以小白鼠為試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，檢測(cè)金黃色葡萄球菌α-溶血素基因工程蛋白亞單位疫苗的抗體效價(jià)和免疫保護(hù)力，初步評(píng)價(jià)

6、此亞單位疫苗的免疫效力。我們建立了ELISA方法測(cè)定抗體效價(jià)，并且通過(guò)攻毒得出疫苗免疫保護(hù)力。所有試驗(yàn)小鼠在首免一周后采集的血清中都檢測(cè)到了特異性抗體，抗體效價(jià)呈逐漸上升趨勢(shì)，達(dá)最高值后逐漸降低，由此可見(jiàn)蛋白疫苗作用機(jī)體產(chǎn)生的抗體水平符合抗體消長(zhǎng)規(guī)律。 試驗(yàn)四奶牛乳腺炎金黃色葡萄球菌FnbpA基因工程疫苗的制備及實(shí)驗(yàn)室免疫效力評(píng)價(jià) 以小白鼠為試驗(yàn)?zāi)Ｐ停瑱z測(cè)金黃色葡萄球菌FnbpA基因工程蛋白亞單位疫苗的抗體效價(jià)水平和免疫