花生四烯酸5-脂氧酶調(diào)節(jié)腦外傷和神經(jīng)突起生長(zhǎng)的作用.pdf

1、5-脂氧酶(ECl.13.11.34,5-lipoxygenase,5-LOX)是機(jī)體催化花生四烯酸(arachidonic acid)生成白三烯類(lèi)生物活性物質(zhì)的限速酶.5-LOx在靜息狀態(tài)下,分布于細(xì)胞漿和細(xì)胞核內(nèi),受到病理因素刺激后,轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核膜代謝花生四烯酸生成產(chǎn)物白三烯(leukotrienes,LrS).近年來(lái),5-LOX的分子生物學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究取得了較大進(jìn)展,提示5-LOX也可能作為一種細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)蛋白起著非酶作用.研究

2、表明,5-LOX在中樞神經(jīng)系統(tǒng)有廣泛分布,并參與了許多神經(jīng)生理與病理過(guò)程. 腦外傷是成年人致死和致殘的重要原因.腦外傷為代表的腦損傷能夠?qū)е乱幌盗械膿p傷反應(yīng),這些反應(yīng)可分為早期和后期(慢性)損傷反應(yīng).在損傷早期,主要的病理生理變化包括興奮性毒性,氧化應(yīng)激,自由基產(chǎn)生,細(xì)胞凋亡,炎癥反應(yīng)和變性.在損傷后期,主要的病理生理變化包括血管增生、神經(jīng)元再生、神經(jīng)環(huán)路重建、反應(yīng)性神經(jīng)膠質(zhì)增生以及神經(jīng)膠質(zhì)疤痕形成(主要由增生的星形膠質(zhì)細(xì)胞組成

3、).有些后期變化(如血管增生,神經(jīng)元再生和神經(jīng)環(huán)路重建)有利于神經(jīng)功能恢復(fù);有些變化(如反應(yīng)性神經(jīng)膠質(zhì)增生以及膠質(zhì)疤痕)不利于恢復(fù). 本論文旨在研究: (1)人腦外傷和星形膠質(zhì)瘤樣本中,5-LOx表達(dá)特點(diǎn);(2)腦外傷動(dòng)物模型(小鼠腦冷凍傷)中,5-LOX表達(dá)特點(diǎn); (3)5-LOX抑制劑咖啡酸對(duì)小鼠腦冷凍傷的保護(hù)作用特點(diǎn),尤其對(duì)損傷后期腦重構(gòu)的星形膠質(zhì)細(xì)胞增生和膠質(zhì)疤痕的作用特點(diǎn); (4)5-LOX對(duì)NGF誘導(dǎo)后PC12細(xì)胞神

4、經(jīng)突起生長(zhǎng)的影響,探討5-LOX參與腦損傷后神經(jīng)環(huán)路重建的作用.從以上幾個(gè)方面,闡明5-LOX在不同病理?xiàng)l件下的調(diào)節(jié)作用,以及作為神經(jīng)保護(hù)作用新的靶點(diǎn)的可能性. 第一部分人腦外傷和星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤的5.脂氧酶表達(dá)特點(diǎn)腦損傷和腦腫瘤的腦組織中,5-LOX代謝產(chǎn)物白三烯的含量升高;有文獻(xiàn)報(bào)道,5-LDX在腦中廣泛分布,且5-LOX抑制劑具有神經(jīng)保護(hù)作用.然而,在人腦外傷以及腦星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤中的5-LOX的表達(dá)特點(diǎn),仍未得到研究.本研究

5、采用免疫組織化學(xué)方法研究在上述疾病中5-LOX腦內(nèi)表達(dá)特點(diǎn).本研究發(fā)現(xiàn),在人腦相對(duì)正常的組織中,5-LOX表達(dá)在神經(jīng)元以及膠質(zhì)細(xì)胞上;未發(fā)現(xiàn)表達(dá)在腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞上.神經(jīng)元中5-LOX有兩種表達(dá)模式:在細(xì)胞核和細(xì)胞漿內(nèi);只在細(xì)胞漿內(nèi).在人腦外傷標(biāo)本中,5-LOX在膠質(zhì)細(xì)胞和中性粒細(xì)胞中表達(dá)增加;雙標(biāo)免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)5-LOX表達(dá)在部分GFAP陽(yáng)性細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞.在腦外傷后8天的病人樣本中,5-LOX表達(dá)在新生的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞上

6、.另一方面,5-LOX高度表達(dá)在高度惡性的星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤(Ⅲ/Ⅳ級(jí))樣本上,并呈顆粒狀分布.這些結(jié)果顯示,5-LOX在神經(jīng)系統(tǒng)中有多種表達(dá)模式,在腦外傷和腫瘤可被誘導(dǎo)表達(dá),提示5-LOX在人腦中有著重要的病理生理作用. 第二部分5-脂氧酶在小鼠腦冷凍傷后的表達(dá)及其抑制劑咖啡酸的保護(hù)作用腦外傷能夠引起早期的神經(jīng)元損傷以及后期的星形膠質(zhì)細(xì)胞增生和膠質(zhì)疤痕形成.近年來(lái)的研究提示,5-LOX可能參與了腦損傷和神經(jīng)退行性變的病理生理過(guò)程.

7、咖啡酸是一種天然的多酚化合物,具有5-LOX抑制作用.本研究采用腦外傷動(dòng)物模型之一的小鼠腦冷凍傷模型,研究5-LOX在腦冷凍傷后的表達(dá)特點(diǎn),并著重觀察5-LOX抑制劑咖啡酸在小鼠腦冷凍傷模型的早期(1天)和晚期(7～28天)的保護(hù)作用特點(diǎn).雙標(biāo)免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在假手術(shù)小鼠大腦皮層,5-LOX主要表達(dá)在神經(jīng)元上.在冷凍傷14天后,損傷周邊區(qū)存活的神經(jīng)元中仍有5-LOX的表達(dá);損傷周邊區(qū)大量增生的星形膠質(zhì)細(xì)胞中,5-LOX有很強(qiáng)的表達(dá).咖

8、啡酸(10和50 mg/kg)能夠減少冷凍傷后1天、7天、14天、21天和28天5個(gè)時(shí)間點(diǎn)的損傷面積.在冷凍傷后期(7至28天),咖啡酸能夠減輕星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖、膠質(zhì)疤痕的形成以及GFAP的蛋白表達(dá).另外,咖啡酸具有抗氧化特性,能夠抑制腦冷凍傷1天后的超氧化物歧化酶活性的降低,并降低丙二醛含量增高.這些結(jié)果提示,5-LOX在腦損傷的早期和后期具有重要的調(diào)節(jié)作用,可能成為腦損傷新的藥物作用靶點(diǎn);具有腦損傷保護(hù)作用的咖啡酸可能成為治療早期

9、和后期腦損傷一個(gè)新的原型化合物. 第三部分5.脂氧酶參與神經(jīng)生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞突起生長(zhǎng)與外周神經(jīng)系統(tǒng)不同,成年的中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷后,神經(jīng)軸突往往很難再生.因而,研究促進(jìn)軸突再生的方法,對(duì)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷(如腦外傷、腦卒中和阿爾采默氏病等)的治療,具有重要意義.5-LOX細(xì)胞生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn),5-LOX能與生長(zhǎng)因子受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)鍵蛋白相互作用,提示5-LOX可能作為一種細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)蛋白起著非酶作用.為闡明5-LOX在

10、腦損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)中的可能作用,本研究使用神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)誘導(dǎo)PCl2細(xì)胞分化模型,研究5-LOX調(diào)節(jié)神經(jīng)突起生長(zhǎng)的作用特點(diǎn).本研究用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和單克隆化技術(shù),建立了穩(wěn)定表達(dá)5-LOX-GFP融合蛋白和GFP的PCl2細(xì)胞株,命名為PC12-5-GFP和PC12-GFP細(xì)胞.經(jīng)NGF誘導(dǎo)的PC12-5-LOX-GFP細(xì)胞株,其神經(jīng)突起陽(yáng)性細(xì)胞百分率,顯著地高于PC12野生型細(xì)胞和PC12-GFP細(xì)胞株.經(jīng)5-LOX反義寡核苷酸處理

11、,PC12野生型細(xì)胞5-LOX表達(dá)降低約40﹪,且在NGF誘導(dǎo)后,神經(jīng)突起陽(yáng)性細(xì)胞百分率顯著地低于PC12野生型細(xì)胞.但是,脂氧酶抑制劑NDGA、5-LOX抑制劑咖啡酸、12-LOX抑制劑黃芩素和CysLTT1受體拮抗劑pranlukast,都不能降低NGF誘導(dǎo)后的神經(jīng)突起生長(zhǎng).這些結(jié)果提示,5-LOX在NGF誘導(dǎo)PC12細(xì)胞細(xì)胞分化的信號(hào)通路中,可能由其非酶作用參與調(diào)節(jié). 1.闡明了5-LOX在相對(duì)正常、腦外傷后和星形膠質(zhì)細(xì)胞

12、瘤中的表達(dá)特點(diǎn).5-LOX在腦外傷中可能參與早期的損傷作用和后期的腦重構(gòu),以及星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤的發(fā)生. 2.闡明了小鼠腦冷凍傷損傷的時(shí)間過(guò)程,5-LOX在小鼠腦冷凍傷后的表達(dá)特點(diǎn).5-LOX抑制劑咖啡酸對(duì)腦冷凍傷后早期和后期的神經(jīng)元損傷有保護(hù)作用,并能抑制后期膠質(zhì)疤痕形成.5-LOX參與調(diào)節(jié)腦損傷的早期和后期損傷,可能成為新的藥物作用靶點(diǎn). 3.在過(guò)表達(dá)和低表達(dá)5-LOX-GFP融和蛋白的PC12細(xì)胞株,NGF誘導(dǎo)的PCI