RNA同時干擾四個不同基因?qū)Ρ茄拾┘毎鸆NE-2Z生長增殖的體內(nèi)外實驗研究.pdf

1、鼻咽癌是我國華南地區(qū)一種常見的惡性腫瘤，且發(fā)病率高。目前鼻咽癌的治療多采用放療為主結(jié)合化療免疫治療及手術(shù)治療、中醫(yī)治療等的綜合療法。但由于放療后易發(fā)生局部復發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移，以及鼻咽癌細胞對化療藥物不敏感和化療藥物的嚴重毒副作用，從而影響了預后，并限制了進一步提高患者生存率。因此，從基因治療的角度，尋找毒性低、療效好、特異性強的新的治療技術(shù)具有重要的臨床意義。
　　 RNA干擾技術(shù)是當今研究鼻咽癌基因治療領(lǐng)域的。一個熱點。它是一種轉(zhuǎn)

2、錄后基因沉默現(xiàn)象，在以往的實驗中，通過單基因RNA干擾能夠抑制腫瘤細胞的生長增殖。然而無論在基礎(chǔ)研究或臨床實驗中，單獨干擾某個基因?qū)ρ芯磕[瘤的防治方面存在有很大局限性。利用分子生物學技術(shù)，針對不同基因發(fā)展的基因治療技術(shù)，通過改變或修飾相關(guān)基因及其表達產(chǎn)物的方式治療惡性腫瘤已成為腫瘤生物治療中最引人注目的研究領(lǐng)域，也可能是惡性腫瘤治療的希望所在。目前國內(nèi)外研究同時干擾多個基因的報道較少。尤其三個以上的基因同時干擾更為少見。聯(lián)合沉默腫瘤細胞

3、中多個癌基因，會成為研究腫瘤基因治療的一個前沿問題。也是腫瘤基因治療中一個新的研究方向。
　　 由于腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多基因突變多步驟多因素共同作用的結(jié)果，我們分析，如果同時阻斷其中的幾條通路，對腫瘤的治療效果可能比只阻斷一條要好，為進一步研究多基因共沉默在腫瘤治療中的作用，我們帶著這樣一個全新觀念需要驗證的思路，通過不同檢驗手段付諸于實驗來驗證多個基因串聯(lián)在一起的真核質(zhì)粒能否同時沉默目的基因的表達并且能否能夠最大限度地發(fā)揮基因沉

4、默的效果。研究多基因共干擾的前提是設(shè)計出一種方法，能夠同時轉(zhuǎn)染干預多個基因的表達。
　　 本實驗通過利用分子生物學基因克隆技術(shù)，VEGF，C—myc，Survivin，hTERT的cDNA序列構(gòu)建并鑒定一個載體同時編碼VEGF，C—myc，Survivin，hTERT四個不同基因的shRNA質(zhì)粒，與干擾單基因進行比較，將其導入CNE—2Z細胞，研究其能否對鼻咽癌細胞生長和增殖的抑制作用誘導細胞凋亡，能否最大限度地提高單個基因的沉

5、默效率，為研究鼻咽癌基因治療奠定實驗基礎(chǔ)并提供治療策略，有望為鼻咽癌基因治療提供一個行之有效的新思路。
　　 方法：
　　 (1)構(gòu)建同時表達VEGF，C—myc，Survivin，hTERT并含熒光素標記的shRNA質(zhì)粒命名為P—1，并構(gòu)建單獨表達VEGF，C—myc，Survivin，hTERT的質(zhì)粒，分別命名為P—2，P—3，P—4，P—5，分別將其將轉(zhuǎn)染人鼻咽癌CNE—2Z細胞株。
　　 (2)以激光共聚

6、焦顯微鏡觀察質(zhì)粒在CNE—2Z細胞轉(zhuǎn)染及表達情況。
　　 (3)以噻唑藍法檢測細胞增殖活性。
　　 (4)real—time—PCR在mRNA水平上檢測對目的基因表達的抑制作用。
　　 (5)免疫印跡法在蛋白水平上檢測對目的基因的封閉效果。
　　 (6)Transwell侵襲小室模型觀察導入CNE—2Z細胞對其惡性生物學行為的改變。
　　 (7)流式細胞儀觀察各組凋亡率。
　　 (8)體內(nèi)

7、裸鼠成瘤：以激光共聚焦顯微鏡觀察質(zhì)粒在移植瘤癌組織中轉(zhuǎn)染及表達情況并通過體積變化，RT—PCR和免疫印跡及TUNNEL凋亡檢測等指標觀察質(zhì)粒對腫瘤的抑制效果。
　　 結(jié)果：
　　 (1)載體構(gòu)建與鑒定質(zhì)粒載體pGenesil1．1，pGenesil1．2，pGenesil1．3，pGenesil1．4里面來只有一個SacI的酶切位點，而質(zhì)粒VEGF，C—cmy，Survivin，hTERT均能夠被SacI所酶切出一條約9

8、00bp，600bp，900bp，600bp不等的DNA條帶，說明目的基因片段VEGF，C—myc，Survivin，hTERT已經(jīng)分別插入到質(zhì)粒載體pGonesil1．1，pGcnesil1．2，pGenesil1．3，pGonesil1．4里。挑取克隆正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌液VEGF，C—myc，Survivin，hTERT去測序。經(jīng)測序結(jié)果分析：均為插入正確的克隆質(zhì)粒，而且質(zhì)量均符合設(shè)計標準。通過本實驗，應用有效的克隆技術(shù)，構(gòu)建出一個載

9、體同時編碼4個不同基因的表達質(zhì)粒，這將為以后多基因共沉默奠定堅實的研究基礎(chǔ)。
　　 (2)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染檢測質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞24h，空白對照組未見表達的綠色熒光細胞。其他各組均可見大量表達綠色熒光的細胞，其中陰性對照組細胞生長良好，有許多貼壁細胞表達綠色熒光。多基因組和各單基因組出現(xiàn)大量懸浮的表達綠色熒光的圓形死亡細胞。其中多基因組凋亡細胞數(shù)較多。我們將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CNE—2Z細胞后共聚焦顯微鏡下觀察到大量表達綠色熒光的細胞，說明質(zhì)粒能有效轉(zhuǎn)

10、染該細胞。
　　 (3)MTT法檢測細胞活力與空白對照組比較，P—1、P—2、P—3、P—4、P—5各組各時間點的細胞吸光度A值均顯著下降，P<0．05；p—1組分別和P—2、P—3、P—4、P—5各組之間比較，p—1組各時間點的吸光度A值差異有統(tǒng)計學意義P<0．05。BC和NC組各時間點的吸光度A值差異沒有統(tǒng)計學意義P>0．05。p—1和P—2、P—3、P—4、P—5轉(zhuǎn)染癌細胞96小時細胞生長抑制率分別達到72％、42％、41

11、％、40％、45％。MTT結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染細胞后，多基因組細胞增殖明顯受抑制，說明同時沉默VEGF，C—myc，Survivin，hTERT四個基因比單獨沉默其中的一個基因能更有效的抑制CNE—2Z細胞的生長。
　　 (4)轉(zhuǎn)染后48小時不同基因在不同組別中的mRNA定量表達．在p—1和p—2中VEGF的抑制率分別是：76．47％±2．08和69．75％±3．05在p—1和p—3中C—myc的抑制率分別是：79．73％±3．01和7

12、7．43％±1．98在p—1和p—4中Survivin的抑制率分別是：80．89％±2．35和73．92％±2．56在p—1和p—5中hTERT的抑制率分別是：74．60％±2．68和70．47％±2．87。實時定量PCR結(jié)果顯示各個單基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CNE—2Z細胞后引起單個基因的mRNA表達下降，多基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CNE—2Z細胞后引起四個基因的mRNA同時表達下降，說明多基因組的mRNA沉默作用強于單基因。
　　 (5)轉(zhuǎn)染48小

13、時后western blotting蛋白檢測。VEGF基因在P—1、P—2中的蛋白抑制率分別是66．95％±2．42和64．30％±3．13，C—myc基因在P—1、P—3中的蛋白抑制率分別是62．89％±2．97和59．18％±3．09 Survivin基因在P—1、P—4中的蛋白抑制率分別是79．48％±1．92和70．51％±2．56hTERT基因在P—1、P—5中的蛋白抑制率分別是79．60％4±1．87和76．33％±4．11

14、。蛋白印記結(jié)果顯示各個單基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CNE—2Z細胞后引起單個基因的蛋白表達下降，多基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CNE—2Z細胞后引起四個基因的蛋白同時表達下降，說明多基因組的蛋白沉默作用強于單基因。
　　 (6)Trans well侵襲小室模型測定細胞體外侵襲能力。7組細胞在48h后Transwell侵襲小室中多基因組穿膜細胞數(shù)比空白對照組和單基因組明顯減少(P<0．05)單基因組和空白對照組穿襲細胞數(shù)也存在統(tǒng)計學差異(P<0．05)，而陰性

15、對照組與空白對照組比較無統(tǒng)計學差異(P>0．05)，表明單基因質(zhì)粒和多基因組質(zhì)粒均可轉(zhuǎn)染可降低CNE—2Z細胞的體外侵襲能力，其中多基因組比單基因組更能明顯地降低鼻咽癌細胞穿襲能力。侵襲實驗結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染細胞后，體外侵襲能力明顯降低，說明同時沉默VEGF，C—myc，Survivin，hTERT四個基因比單獨沉默其中的一個基因能更有效地降低惡性侵襲力。
　　 (7)流式細胞儀檢測細胞凋亡。處理48小時后，空白對照組凋亡率是5．3％

16、±1．26，陰性對照組凋亡率是7．4％±1．02，p—1組凋亡率是37．6％±0．94，p—2組凋亡率是20．6％±1．27，p—3組凋亡率是22．6％±0．98，p—4組凋亡率是23．7％±1．09，p—5組凋亡率是22．9％±1．31，空白對照組和陰性對照組凋亡率比較二者之間沒有統(tǒng)計學差異(p>0．05)。單基因組與空白對照組凋亡率比較二者之間有明顯統(tǒng)計學差異(p<0．05)。多基因組與空白對照組凋亡率比較二者之間有明顯統(tǒng)計學差異(

17、p<0．01)。單基因和多基因組凋亡率比較二者之間具有明顯統(tǒng)計學差異(p<0．05)。流式細胞儀檢測細胞凋亡實驗表明同時沉默腫瘤細胞中多個基因比單獨沉默一個基因能夠更好的誘導腫瘤細胞凋亡。
　　 (8)癌裸鼠動物模型的治療效果?？瞻讓φ战M和陰性對照組裸鼠腫瘤持續(xù)增長，體積明顯增大；多基因治療組和單基因治療組腫瘤生長緩慢，其中多基因治療腫瘤生長速度最慢．熒光顯微鏡下觀察質(zhì)粒治療組和陰性對照組可見大片癌組織表達綠色熒光，而空白對照組

18、的移植瘤未見綠色熒光。在治療結(jié)束時，P—1，P—2、P—3、P—4、P—5組腫瘤比空白對照組腫瘤生長明顯受到抑制。各組抑瘤率分別是，P—1：82．40％、P—2：46．24％、P—3：48．47％、P—4：51．93％、P—5：46．78％．TUNEL法檢測移植瘤細胞凋亡率：空白對照組和陰性對照組偶可見凋亡細胞，凋亡指數(shù)為分別為2．8±01．12、3．7±0．95；VEGF、C—myc、Survivin和hTERT單基因質(zhì)粒組凋亡細胞凋

19、亡指數(shù)分別為21．5％±2．31、23．8％±1．98、19．9％±2．75和24．60％±3．09。多基因質(zhì)粒組凋亡細胞明顯增多凋亡指數(shù)為49．8％±1．98。表明單基因組和多基因組對鼻咽癌移植瘤均有誘導凋亡作用，其中多基因組誘導凋亡作用最明顯。
　　 結(jié)論：
　　 本實驗首次通過多基因干擾證實了不同基因的沉默導致相應mRNA及目的蛋白的表達下調(diào)，從而有效抑制鼻咽癌細胞增殖并誘導其凋亡，移植瘤生長明顯受到抑制，初步證實