RNA干擾YAP基因?qū)ξ赴┥L及轉(zhuǎn)移影響的體內(nèi)外研究.pdf

1、背景和目的:胃癌是我國最常見的消化道惡性腫瘤之一,具有發(fā)病隱匿、易轉(zhuǎn)移,發(fā)病率高和死亡率高等特點[1]。目前主要治療方法有手術(shù)和化療等,但對進展期胃癌的療效不佳。隨著對腫瘤發(fā)病機制研究的不斷深人,人們發(fā)現(xiàn)癌基因的激活是腫瘤發(fā)病的主要原因之一。阻斷癌基因的高表達可以防止正常細胞向惡性轉(zhuǎn)化,甚至可使惡性腫瘤向正常方向轉(zhuǎn)化,從而根治腫瘤[2]。因此,以抑制癌基因表達為重要內(nèi)容之一的基因治療成為人們關(guān)注的熱點。
　　YAP(yes-ass

2、ociated protein,YAP)基因于1994年發(fā)現(xiàn),最早發(fā)現(xiàn)是因為其通過"PVKQPPPLAP"序列與Src蛋白激酶家族中Yes蛋白的SH3區(qū)域相結(jié)合而命名為Yes-associated proteint[3]。近來的研究證明YAP是一個癌基因,作為Hippo通路的下游信號分子,YAP具有促進細胞增殖,抑制細胞調(diào)亡,導(dǎo)致細胞接觸性抑制喪失并促進細胞惡性轉(zhuǎn)化的作用[4]。在食管癌[5],肝癌[6],肺癌[7]中都發(fā)現(xiàn)了YAP基因

3、的高表達。但是YAP在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用還未進行深入研究,因此,本實驗設(shè)計了針對YAP基因的短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA,shRNA)序列,構(gòu)建YAP基因穩(wěn)定干擾的胃癌細胞株,探討YAP基因在胃癌發(fā)生發(fā)展中的體內(nèi)外作用。
　　方法:1.制備慢病毒穩(wěn)定干擾YAP基因表達的胃癌SGC-7901細胞系;2.MTT法檢測YAP基因沉默對胃癌細胞牛長的影響,流式細胞儀檢測YAP基因沉默對胃癌細胞周期及凋亡水平的影響,w

4、estern blot和RT-RCR檢測YAP基因沉默后腫瘤細胞生長,細胞周期相關(guān)因子的表達變化;3.Transwell侵襲實驗,細胞劃痕修復(fù)實驗檢測YAP基因沉默對胃癌侵襲和遷移能力的影響,集落形成實驗檢測YAP基因沉默對胃癌細胞克隆形成的影響,western blot和RT-RCR檢測YAP基因沉默后腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)因子的表達變化;4.運用體外實驗建立的胃癌細胞株構(gòu)建裸鼠皮下移植瘤模型和重度聯(lián)合免疫缺陷小鼠(severe combine

5、dimmuno-deficient mice,SCID)原位胃癌模型,觀察皮下及原位腫瘤牛長及轉(zhuǎn)移情況。免疫組織化學染色法、western blot以及RT-RCR檢測YAP基因沉默后原位胃癌中YAP基因mRNA和蛋白質(zhì)的表達變化,免疫組織化學染色法檢測YAP基因沉默后原位胃癌組織中細胞凋亡,增殖,細胞周期相關(guān)因子的表達變化,western blot檢測YAP相關(guān)下游通路因子的表達水平,免疫組織化學染色法、western blot以及R

6、T-RCR檢測YAP基因沉默后原位胃癌中血管生長水平的變化。
　　結(jié)果:1.成功構(gòu)建慢病毒穩(wěn)定干擾YAP基因表達的胃癌細胞株SGC-7901,同時構(gòu)建陰性對照慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SGC-7901胃癌細胞株,YAP基因干擾后能明顯抑制YAP基因在胃癌細胞中mRNA(0.163±0.010(YAP-shRNA)vs1.103±0.090(CON),P＜0.01;0.163±0.010(YAP-shRNA)vs1.011±0.033(NC)

7、,P＜0.01)和蛋白質(zhì)(0.255±0.014(YAP-shRNA) vs0.889±0.055(CON),P＜0.01;0.255±0.014(YAP-shRNA)vs0.861±0.016(NC),P＜0.01)的表達;2.MTT染色顯示YAP基因干擾組胃癌細胞增殖在48h和72h明顯受到抑制;流式細胞儀檢測顯示CON組,NC組,YAP-shRNA組胃癌細胞凋亡率分別為9.75％,10.69％,42.1％,YAP-shRNA組凋亡

8、明顯增加;干擾后,細胞周期停滯于G0/G1期,細胞因子cyclinDl,ki-67,增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA),survivin表達降低(P＜0.01),cyclinA,cyclinE及AFP表達無統(tǒng)計學差異(P＞0.05);3.Transwell侵襲實驗顯示:YAP基因干擾組胃癌細胞侵襲能力降低。YAP-shRNA組穿透基質(zhì)膠的細胞數(shù)明顯低于CON組和NC組(239

9、.0±8.6(CON)vs144.8±8.3(YAP-shRNA),P＜0.01;233.4±5.2(NC)vs144.8±8.3(YAP-shRNA),P＜0.01);細胞劃痕修復(fù)實驗顯示:YAP基因干擾組胃癌細胞遷移能力減弱;集落形成實驗顯示:YAP基因干擾組胃癌細胞克隆形成能力降低(27.33±2.88(CON)vs.9.00±1.00(YAP-shRNA),P＜0.01;22.67±1.53(NC)vs.9.00±1.00(YA

10、P-shRNA),P＜0.01);血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor-2,FGF-2)表達水平均降低;4.成功構(gòu)建胃癌裸鼠皮下移植瘤模型及SCID小鼠原位胃癌模型,與對照組比較,YAP基因干擾組胃癌牛長緩慢,皮下瘤(0.648±0.075(CON)vs.0.203±0.017(YAP-shRNA),P＜0

11、.01;0.597±0.054(NC)vs.0.203±0.017(YAP-shRNA),P＜0.01)及原位瘤(0.292±0.029(YAP-shRNA)vs.0.657±0.038(NC),P＜0.01;0.292±0.029(YAP-shRNA)vs.0.715±0.054(CON),P＜0.01)的重量均低于對照組,干擾組原位胃癌轉(zhuǎn)移率降低,YAP mRNA及蛋白質(zhì)在原位腫瘤中表達降低;YAP基因干擾后原位胃癌中細胞增殖水平降

12、低(0.259±0.040(YAP-shRNA)vs.0.775±0.080(NC),P＜0.01;0.259±0.040(YAP-shRNA)vs.0.875±0.061(CON),P＜0.01),凋亡水平增加(0.676±0.071(YAP-shRNA)vs.0.315±0.054(NC),P＜0.01;0.676±0.071(YAP-shRNA)vs.0.269±0.059(CON),P＜0.01);細胞周期因子cyclinD1表

13、達水平降低,cyclinA和cyclinE表達水平無明顯差異;并且,YAP基因干擾后原位胃癌血管牛成能力減弱(6.17±1.47(YAP-shRNA)vs.19.83±3.31(NC),P＜0.01;6.17±1.47(YAP-shRNA)vs.24.33±3.93(CON),P＜0.01),VEGF及FGF-2表達水平降低;YAP基因調(diào)節(jié)胃癌細胞生長可能通過YAP/β-catenin/cyclinD1細胞信號通路。
　　結(jié)論:1