高溫對(duì)小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元骨架蛋白和熱休克蛋白70表達(dá)的影響.pdf

1、隨著全球氣候的變暖，高溫導(dǎo)致的神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂越來越多見。熱應(yīng)激環(huán)境下，當(dāng)人體維持熱平衡的汗液蒸發(fā)降溫超過環(huán)境中的最大蒸發(fā)量時(shí)，體內(nèi)熱量蓄積，下丘腦調(diào)節(jié)熱蓄積和熱消散平衡失敗，人體的熱平衡被破壞，體核溫度持續(xù)升高，導(dǎo)致中暑高熱、虛脫。軍隊(duì)的日常訓(xùn)練及實(shí)戰(zhàn)常處在高溫環(huán)境中，某些特殊兵種(如坦克兵、防化兵)要長(zhǎng)期在高溫環(huán)境下生活、工作。此外，由于疾病導(dǎo)致體溫過高或持續(xù)時(shí)間過長(zhǎng)的發(fā)熱等情況的存在，致使中署、熱痙攣、熱衰竭等疾病更易發(fā)生，出現(xiàn)頭

2、痛、驚厥、昏迷等癥狀。因此，研究高溫應(yīng)激對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害機(jī)制，從而研制和開發(fā)出各種保護(hù)技術(shù)和設(shè)備，就具有重要的軍事意義和應(yīng)用價(jià)值。 從低等動(dòng)物細(xì)菌到高等動(dòng)物人類，受高溫作用后均可發(fā)生熱應(yīng)激反應(yīng)，此反應(yīng)的特點(diǎn)是選擇性合成一組多肽——熱休克蛋白(HSPs)，它是一種保護(hù)機(jī)體的蛋白，由細(xì)胞核內(nèi)高度保守的熱應(yīng)激基因編碼的產(chǎn)物。HSPs一般按照其相對(duì)分子質(zhì)量的大小進(jìn)行分類，其中HSP70在熱應(yīng)激中升高最顯著，作用也最大。 盡管存

3、在爭(zhēng)議，多項(xiàng)研究表明高溫可導(dǎo)致不同程度的腦損傷，而神經(jīng)元的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)改變則被認(rèn)為是最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡的微觀基礎(chǔ)。細(xì)胞骨架按纖維直徑的大小可分為微管、微絲、中間纖維以及纖維網(wǎng)。微絲是由α-tubulin和β-tubulin異二構(gòu)體形成的原微絲構(gòu)成，是神經(jīng)元骨架蛋白重要的組成部分。細(xì)胞骨架的完整性對(duì)維持神經(jīng)系統(tǒng)正常生理功能具有至關(guān)重要的作用。 因此詳細(xì)了解熱應(yīng)激對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷機(jī)制，以及HSPs在此過程中的作用，可以為尋找熱應(yīng)激

4、損傷神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)性方法和技術(shù)提供有益的思路。目前的研究表明高溫可導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育畸形，記憶力下降，而在體外培養(yǎng)的神經(jīng)元上，這方面的報(bào)道較少。本研究旨在體外培養(yǎng)神經(jīng)元高溫?fù)p傷模型的基礎(chǔ)上，探討高溫?fù)p傷后神經(jīng)元的形態(tài)、骨架蛋白及HSP70的改變，初步探討HSP70的神經(jīng)元保護(hù)作用，希望能為高溫導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)損傷的機(jī)制及治療做一些有益的基礎(chǔ)工作。 本實(shí)驗(yàn)在建立的小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元高溫?fù)p傷模型基礎(chǔ)上，將培養(yǎng)的皮質(zhì)神經(jīng)元分為未經(jīng)高溫處理的

5、對(duì)照組、高溫處理的實(shí)驗(yàn)組，采用倒置顯微鏡、免疫熒光雙標(biāo)記法結(jié)合激光共聚焦掃描等方法，觀察對(duì)照組及處理組各溫度下?lián)p傷的神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)、骨架蛋白β-tubulin和HSP70的表達(dá)變化。本次實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果如下： [1]光鏡觀察：在倒置顯微鏡下，正常神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后呈圓形。接種培養(yǎng)后10h，胞體增大呈圓形或橢圓形，分散的神經(jīng)細(xì)胞開始貼壁。24h后大部分神經(jīng)細(xì)胞貼壁，突起延長(zhǎng)，開始相互連接。7d后細(xì)胞光暈明顯，胞體飽滿并聚集成團(tuán)，

6、細(xì)胞團(tuán)間有粗大的突起并相互連接，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)稠密。處理組高溫后漂浮細(xì)胞增加，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目減少，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)稀疏，有的細(xì)胞突起漂浮，有的失去突起，呈圓形或橢圓形。這種形態(tài)改變溫度越高越明顯。 [2]激光共聚焦顯微鏡觀察：高溫處理組38、39、40、41、42℃熱刺激后β-tubulin熒光強(qiáng)度低于正常對(duì)照組，且溫度愈高，降低愈明顯。HSP70熒光強(qiáng)度呈鐘形分布，39℃最高，37℃、42℃最低。高溫時(shí)間組39℃刺激后不同恢復(fù)時(shí)間點(diǎn)(0，2，

7、6，24，72h)神經(jīng)元β-tubulin熒光強(qiáng)度均低于對(duì)照組，且隨恢復(fù)時(shí)間延長(zhǎng)β-tubulin熒光強(qiáng)度值逐漸升高。高溫時(shí)間組39℃刺激后不同恢復(fù)時(shí)間點(diǎn)(0，2，6，24，72h)HSP70熒光強(qiáng)度均高于對(duì)照組。且隨恢復(fù)時(shí)間的延長(zhǎng)HSP70熒光強(qiáng)度值先升高后降低，于2h時(shí)達(dá)高峰，24h仍維持在較高的水平。 [3]熒光顯微鏡觀察：高溫時(shí)間組39℃刺激后，HSP70蛋白由細(xì)胞漿轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)聚集，停止刺激后再逐漸轉(zhuǎn)移回細(xì)胞漿中。

8、 本次實(shí)驗(yàn)結(jié)論如下： [1]高溫刺激會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元形態(tài)和軸突發(fā)生變化，出現(xiàn)神經(jīng)元凋亡或死亡，溫度越高損傷越嚴(yán)重。 [2]神經(jīng)元熱損傷中骨架蛋白β-tubulin發(fā)生了變化，可能發(fā)生了蛋白的解聚、錯(cuò)折疊，部分可能發(fā)生了變性。但隨著恢復(fù)時(shí)間的延長(zhǎng)，這些骨架蛋白又重新聚合、正確折疊，變性的蛋白降解。 [3]體外培養(yǎng)的神經(jīng)元在正常溫度和高溫環(huán)境中均有HSP70表達(dá)。高溫刺激后HSP70的表達(dá)明顯高于正常溫度。這可能是