PTSD藍斑神經(jīng)元骨架蛋白表達與β-catenin信號調(diào)控細胞凋亡的研究.pdf

1、目的:
　　 創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(PTSD)是指由異常威脅性或災(zāi)難性心理創(chuàng)傷導(dǎo)致延遲出現(xiàn)和長期持續(xù)的精神障礙。其特征性的癥狀為病理性重現(xiàn)創(chuàng)傷體驗、持續(xù)性警覺增高、持續(xù)性回避、對創(chuàng)傷性經(jīng)歷的選擇性遺忘以及對未來失去信心等。隨著現(xiàn)代社會交通傷亡、暴力事件等社會應(yīng)激事件的增多和自然災(zāi)害(如地震、火山、洪水等)的發(fā)生,PTSD已經(jīng)成為影響創(chuàng)傷救治整體水平的重要因素之一,嚴重干擾了人民生活和社會秩序而備受關(guān)注。
　　 應(yīng)激反應(yīng)主要由交

2、感腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)(SAS)的快速激活和下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPAaxis)的興奮激活來激發(fā),且二者之間存在著協(xié)同性。許多研究顯示,PTSD患者其血、尿中的最終靶激素-糖皮質(zhì)激素(glicocorticoid,GC)水平卻低于正常;與此同時,SAS則表現(xiàn)出高活動性。因此,PTSD患者中可能存在著HPA與SAS的“分離”現(xiàn)象,即GC不能限制、調(diào)節(jié)SAS反應(yīng),導(dǎo)致兒茶酚胺(由SAS釋放)所致的記憶加強。藍斑(locuscoeruleus,

3、LC)主要由去甲腎上腺素能細胞構(gòu)成,是腦內(nèi)去甲腎上腺素能細胞的主要集中地,參與調(diào)節(jié)植物性神經(jīng)活動。藍斑能纖維影響中樞所有區(qū)域的神經(jīng)活動,與排尿、學(xué)習(xí)記憶、嗅行為、呼吸、循環(huán)、泌尿、針刺鎮(zhèn)痛和睡眠(調(diào)節(jié)異相睡眠)等機能有關(guān)。此外,藍斑可通過其廣泛傳出聯(lián)系維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的覺醒狀態(tài)。
　　 藍斑對應(yīng)激的反應(yīng)是經(jīng)藍斑到杏仁核、海馬的通路,通過激活邊緣系統(tǒng)來完成。目前基于動物實驗的數(shù)據(jù)表明:在一個創(chuàng)傷后藍斑通路經(jīng)過長期的強化,特別在應(yīng)激

4、的狀態(tài)下,成為重復(fù)闖入性再體驗的基礎(chǔ),這一現(xiàn)象是研究PTSD疾病的一個突破口。細胞骨架蛋白的變化勢必會影響細胞的功能,并有可能啟動神經(jīng)元的自殺程序,引起凋亡。生長錐蛋白是凋亡相關(guān)蛋白,生長錐蛋白-紐蛋白(vinculin)是重要的凋亡蛋白。縫隙連接蛋白(Connexin43,Cx43)和整合素(Lntegrin)是細胞間連接蛋白,在細胞凋亡中也出現(xiàn)相應(yīng)的改變。Caspase-12(半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-12)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)凋亡途徑的

5、關(guān)鍵凋亡因子。Nakagawa等證實caspase-12)存于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上,他在誘導(dǎo)細胞ERS(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激)實驗中,發(fā)現(xiàn)細胞出現(xiàn)凋亡,而caspase-12基因缺乏細胞經(jīng)ERS反應(yīng)時,細胞凋亡受抑制,說明caspase-12是ERS反應(yīng)誘導(dǎo)凋亡的關(guān)鍵分子。PTSD是引起細胞應(yīng)激性反應(yīng),故檢測caspase-12表達變化是否引起細胞凋亡。
　　 β-catenin(β-連環(huán)蛋白)是wnt通路中的關(guān)鍵因子,Wnt通路與多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路存

6、在“對話”,參與多種細胞發(fā)育和細胞死亡的調(diào)節(jié)。它可以通過多種機制來控制細胞的凋亡,Rhee等研究發(fā)現(xiàn),在一些細胞受損發(fā)生凋亡時,Wnt通路通過β-catenin/Tcf的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)途徑來調(diào)節(jié)細胞凋亡。Wnt通路也可以抑制線粒體釋放細胞色素C從而抑制細胞凋亡。
　　 “單一連續(xù)刺激(singleprolongedstress,SPS)”SPS動物模型是目前探討PTSD發(fā)病機制的較理想的實驗?zāi)Ｐ?該方法已經(jīng)被國際所認同。因此本研究采用

7、PTSDSPS模型,采用免疫組織化學(xué)、Western及RT-PCR方法,從蛋白和分子水平檢測整合素、縫隙連接蛋白、紐蛋白及β-catenin,并用RT-PCR方法檢測caspase-12mRNA的改變,旨在探討PTSD藍斑神經(jīng)元凋亡導(dǎo)致功能紊亂的發(fā)生機制,為揭示PTSD的發(fā)病機制提供實驗依據(jù)。
　　 實驗方法:
　　 1、模型制作及分組
　　 采用2005年日本文部省召開的國際PTSD科學(xué)會議確定的SPS模型。其

8、具體方法是將大鼠按下述步驟連續(xù)進行處理:固定刺激2h;強迫性游水20min,水深40cm,水溫25℃;休息15min;乙謎麻醉至意識喪失;無干擾空間常規(guī)喂養(yǎng)。隨機分為5組,即正常對照組及SPS1d、4d、7d、和14d組。
　　 2、免疫組織化學(xué)方法檢測整合素、縫隙連接蛋白、紐蛋白及β-catenin的表達
　　 免疫組化:分別選取各組大鼠灌流固定、沉糖的大腦,制作石蠟切片,分別用SABC法進行藍斑的骨架蛋白、β-cat

9、enin免疫組織化學(xué)染色,DAB顯色,中性樹膠封片,光學(xué)顯微鏡觀察,攝片。
　　 3、WesternBlotting方法檢測整合素、縫隙連接蛋白、紐蛋白及β-catenin的表達
　　 WesternBlotting:分別取新鮮藍斑經(jīng)勻漿、超聲粉碎后高速低溫離心,提取上清蛋白,電泳,轉(zhuǎn)膜,經(jīng)封閉后分別加一抗4℃過夜;HRP標(biāo)記IgG孵育2h,ECL發(fā)光,檢測條帶各光密度值。
　　 4、RT-PCR法檢測整合素、縫

10、隙連接蛋白、β-catenin及Caspase-12的mRNA表達
　　 RT-PCR:斷頭取腦分離藍斑,提取總RNA,進行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴增。擴增結(jié)束后進行凝膠電泳,成像并進行積分光密度分析。
　　 5、透射電鏡技術(shù)觀察藍斑神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)改變
　　 常規(guī)電鏡制樣,倒扣包埋、聚合、半薄切片定位,AO超薄切片機進行超薄切片,透射電鏡下觀察。
　　 結(jié)果:
　　 1、整合素、縫隙連接蛋白的免疫組化、W

11、esternBlotting及RT-PCR的檢測結(jié)果
　　 陽性細胞均在細胞胞質(zhì)中表達,各項表達均于SPS4d達高峰,SPS7d和SPS14d逐漸下降。
　　 2、β-catenin免疫組化、WesternBlotting的檢測結(jié)果
　　 β-catenin陽性細胞表達在SPS各組細胞胞質(zhì)中,各項表達呈逐漸下調(diào)趨勢。
　　 3、透射電鏡技術(shù)觀察藍斑神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)改變
　　 SPS后,藍斑神經(jīng)元發(fā)生

12、了超微結(jié)構(gòu)改變,核內(nèi)染色質(zhì)濃縮邊集。核膜下陷,核皺縮,出現(xiàn)凋亡的特征性結(jié)構(gòu)改變。
　　 4、凋亡因子Caspase-12RT-PCR的檢測結(jié)果
　　 SPS刺激后,Caspase-12mRNA表達于1d表達明顯增加,4d時表達最多,之后漸趨下降。
　　 結(jié)論:
　　 1、PTSD大鼠藍斑神經(jīng)元整合素、縫隙連接蛋白及紐蛋白的表達變化與藍斑神經(jīng)元的細胞凋亡相關(guān)。
　　 2、PTSD大鼠藍斑神經(jīng)元各時間