肺表面活性蛋白SP-B定位及模擬肽生物活性初步研究.pdf

1、疏水性肺表面活性蛋白B（SurfactantproteinB,SP-B）是發(fā)現(xiàn)最早的肺表面活性蛋白，能夠與肺泡表面的磷脂相互作用形成穩(wěn)定的肺表面活性物質(puLmonarysurfactant,PS)分子層，從而維持肺泡形態(tài)和良好的肺順應性。近年來肺表面活性物質逐漸成為治療急性肺損傷(AcuteLungInjury,ALI)的重要藥物之一。現(xiàn)上市的肺表面活性物質絕大多數(shù)為天然提取物，主要成分為肺表面活性蛋白與磷脂的混合物，SP-B是其發(fā)

2、揮重要作用的成份之一。但由于原料來源的局限、生產(chǎn)的高成本、以及可能會發(fā)生免疫反應和細菌感染等因素限制了其臨床的應用。因此，人工合成其關鍵成份是近年研究的趨勢。
　　研究目的：
　　本研究在深入了解大鼠SP-B定位以及其序列電荷分布、二級結構和疏水性特點的基礎上，設計和篩選最佳SP-B模擬肽結構。人工合成SP-B模擬肽，并對合成的SP-B模擬肽體外活性、對脂質構象和功能的影響、對大鼠離體肺順應性的作用等進行測定，旨在為進一步深

3、入研究開發(fā)人工肺表面活性物質奠定基礎。
　　研究方法：
　　①SP-B蛋白的定位研究：利用免疫熒光技術檢測SP-B蛋白在肺組織中定位。利用基因重組方法構建質粒pEGFP-N2-SP-B，并通過脂質體轉染至CCL-149與A549細胞系。
　?、谀M肽的設計、篩選與合成：通過生物信息學工具對模擬肽設計、篩選并采用標準的Fmoc固相化學合成方法合成。
　　③模擬肽的體外活性初步測定：利用脂質體構建模擬膜，采用Wilh

4、elmy式膜天平對模擬肽體外初步活測定。
　?、苣M肽與脂質相互作用研究：利用拉曼光譜測定模擬肽對脂質反式與扭曲等構象信息的變化情況。
　　⑤體內活性研究：建立大鼠離體肺灌洗模型，肺內滴注模擬肽制劑，測定大鼠離體肺順應性。
　　研究結果：
　?、倮妹庖邿晒獯_定了SP-B蛋白在肺組織中定位。成功構建了pUC-T-SP-B與pEGFP-N2-SP-B重組質粒，測序結果正確。質粒轉染結果顯示SP-B在A549細胞系中

5、主要定位于細胞質中，而在CCL-149細胞系中主要定位于細胞核與細胞膜上，SP-B有可能為膜蛋白。
　?、谕ㄟ^生物信息學工具設計、篩選出了模擬肽KAAVV。委托吉爾生化公司合成多肽，HPLC結果顯示純度達到98.6％，質譜分子量結果與理論值一致。
　　③成功構建脂質體模擬膜，初步體外活性測定顯示其能夠有效降低氣液表面張力。
　?、芾庾V分析結果顯示在加入多肽后，使DPPC與DPPG的C-C骨架有序性構象降低，鏈間無序