肺表面活性蛋白SP-B定位及模擬肽生物活性初步研究.pdf

1、疏水性肺表面活性蛋白B（SurfactantproteinB,SP-B）是發(fā)現(xiàn)最早的肺表面活性蛋白，能夠與肺泡表面的磷脂相互作用形成穩(wěn)定的肺表面活性物質(zhì)(puLmonarysurfactant,PS)分子層，從而維持肺泡形態(tài)和良好的肺順應(yīng)性。近年來(lái)肺表面活性物質(zhì)逐漸成為治療急性肺損傷(AcuteLungInjury,ALI)的重要藥物之一。現(xiàn)上市的肺表面活性物質(zhì)絕大多數(shù)為天然提取物，主要成分為肺表面活性蛋白與磷脂的混合物，SP-B是其發(fā)

2、揮重要作用的成份之一。但由于原料來(lái)源的局限、生產(chǎn)的高成本、以及可能會(huì)發(fā)生免疫反應(yīng)和細(xì)菌感染等因素限制了其臨床的應(yīng)用。因此，人工合成其關(guān)鍵成份是近年研究的趨勢(shì)。
　　研究目的：
　　本研究在深入了解大鼠SP-B定位以及其序列電荷分布、二級(jí)結(jié)構(gòu)和疏水性特點(diǎn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)和篩選最佳SP-B模擬肽結(jié)構(gòu)。人工合成SP-B模擬肽，并對(duì)合成的SP-B模擬肽體外活性、對(duì)脂質(zhì)構(gòu)象和功能的影響、對(duì)大鼠離體肺順應(yīng)性的作用等進(jìn)行測(cè)定，旨在為進(jìn)一步深

3、入研究開(kāi)發(fā)人工肺表面活性物質(zhì)奠定基礎(chǔ)。
　　研究方法：
　?、賁P-B蛋白的定位研究：利用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)SP-B蛋白在肺組織中定位。利用基因重組方法構(gòu)建質(zhì)粒pEGFP-N2-SP-B，并通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至CCL-149與A549細(xì)胞系。
　?、谀M肽的設(shè)計(jì)、篩選與合成：通過(guò)生物信息學(xué)工具對(duì)模擬肽設(shè)計(jì)、篩選并采用標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc固相化學(xué)合成方法合成。
　?、勰M肽的體外活性初步測(cè)定：利用脂質(zhì)體構(gòu)建模擬膜，采用Wilh

4、elmy式膜天平對(duì)模擬肽體外初步活測(cè)定。
　?、苣M肽與脂質(zhì)相互作用研究：利用拉曼光譜測(cè)定模擬肽對(duì)脂質(zhì)反式與扭曲等構(gòu)象信息的變化情況。
　?、蒹w內(nèi)活性研究：建立大鼠離體肺灌洗模型，肺內(nèi)滴注模擬肽制劑，測(cè)定大鼠離體肺順應(yīng)性。
　　研究結(jié)果：
　?、倮妹庖邿晒獯_定了SP-B蛋白在肺組織中定位。成功構(gòu)建了pUC-T-SP-B與pEGFP-N2-SP-B重組質(zhì)粒，測(cè)序結(jié)果正確。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染結(jié)果顯示SP-B在A549細(xì)胞系中

5、主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，而在CCL-149細(xì)胞系中主要定位于細(xì)胞核與細(xì)胞膜上，SP-B有可能為膜蛋白。
　　②通過(guò)生物信息學(xué)工具設(shè)計(jì)、篩選出了模擬肽KAAVV。委托吉爾生化公司合成多肽，HPLC結(jié)果顯示純度達(dá)到98.6％，質(zhì)譜分子量結(jié)果與理論值一致。
　　③成功構(gòu)建脂質(zhì)體模擬膜，初步體外活性測(cè)定顯示其能夠有效降低氣液表面張力。
　?、芾庾V分析結(jié)果顯示在加入多肽后，使DPPC與DPPG的C-C骨架有序性構(gòu)象降低，鏈間無(wú)序