miRNA 200c對A549-MTX耐藥細胞遷移和侵襲作用的研究.pdf

1、背景:miRNA-200c是miRNA200家族重要的成員之一，大量研究表明miRNA-200c可作為許多腫瘤篩查分子標志物和預(yù)后判斷的重要指標，其能夠抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移，增加腫瘤細胞對抗腫瘤藥物的敏感性。氨甲喋呤(Methotrexate，MTX)是目前應(yīng)用最廣泛的抗葉酸制劑，然而應(yīng)用MTX治療極易產(chǎn)生獲得性耐藥，耐藥后轉(zhuǎn)移是其治療失敗的主要原因。探尋影響耐藥后的腫瘤細胞遷移和侵襲能力的相關(guān)分子，以便進一步研究和掌握耐藥的

2、作用機理，作為腫瘤的攻克及控制的分子理論依據(jù)，從而為克服MTX獲得性耐藥后腫瘤侵襲力增加的治療提供思路。E-cad(E-cadherin，E-cad)是一類鈣依賴性跨膜糖蛋白，有研究者認為其表達或功能異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且有研究表明其受Zeste基因增強子同源物2(Enhancer ofzeste homolog2，EZH2)調(diào)節(jié)來改變對細胞遷移及侵襲的影響。本研究以肺癌A549/MTX細胞作為研究對象，研究miRNA

3、-200c對A549/MTX耐藥細胞遷移和侵襲能力的作用，及其與EZH2/E-cad通路的相關(guān)性。
　　目的:探討miRNA-200c對A549/MTX耐藥細胞遷移和侵襲力的作用，同時研究miRNA-200c對A549/MTX耐藥細胞遷移和侵襲力的作用與EZH2/E-cad信號通路之間的關(guān)系。
　　方法:通過藥物濃度逐漸增加并結(jié)合低劑量持續(xù)誘導(dǎo)的方法，誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得25μM甲氨蝶呤(MTX)耐受的肺癌A549細胞系(A549/

4、MTX)，然后來分別觀察誘導(dǎo)前與誘導(dǎo)后細胞形態(tài)學的改變，使用MTT方法檢測A549/MTX細胞耐藥指數(shù)（Resistance drug index，RI）;判斷耐藥細胞誘導(dǎo)情況，選擇耐藥程度高的細胞作為主要研究對象，隨后使用miRNA-200c前體片段和陰性片段轉(zhuǎn)染A549/MTX細胞株，使用實時熒光定量PCR(Real-time fluorescencequantitative-PCR，RT-PCR)來檢測miRNA-200c的表達量

5、，從而證實轉(zhuǎn)染是否成功以及轉(zhuǎn)染后的miRNA-200c的表達量的變化;同時觀察細胞形態(tài)學的變化，另外分別使用細胞劃痕實驗(Wound Healing)和細胞遷移侵襲實驗（transwell）來分析轉(zhuǎn)染陽性成功后的耐藥細胞較轉(zhuǎn)染陰性的耐藥細胞的遷移與侵襲能力的變化;同時通過實時熒光定量PCR方法來了解轉(zhuǎn)染成功后EZH2和E-鈣黏蛋白基因表達水平的變化，探討miRNA200c對A549/MTX細胞遷移和侵襲力產(chǎn)生影響的信號通路與EZH2/E

6、-cad信號通路之間的相關(guān)性。
　　結(jié)果:經(jīng)過誘導(dǎo)得到25μM MTX耐藥的A549細胞的耐藥指數(shù)為15.7，為高度耐藥。通過轉(zhuǎn)染試劑盒轉(zhuǎn)染細胞，將25μM MTX高度耐藥的A549細胞轉(zhuǎn)染miRNA200c的前體片段后的A549/MTX細胞的miRNA-200c的表達水平比轉(zhuǎn)染陰性片段的同種耐藥細胞的miRNA200c表達量明顯升高，高出約7.2倍，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，間接說明轉(zhuǎn)染是成功的。誘導(dǎo)耐藥后及轉(zhuǎn)染后較敏

7、感細胞A549細胞細胞形態(tài)均發(fā)生變化。細胞劃痕實驗和Transwell實驗結(jié)果顯示，經(jīng)miRNA-200c前體片段轉(zhuǎn)染成功的A549/MTX細胞的遷移和侵襲力較轉(zhuǎn)染陰性的A549/MTX細胞出現(xiàn)了顯著的降低現(xiàn)象，差異明顯(P＜0.05)具有統(tǒng)計學意義。RT-PCR檢測EZH2和E-cad表達水平的結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染陰性組比較，miRNA-200c轉(zhuǎn)染成功的A549/MTX細胞表達EZH2的水平降低，而表達E-cad的水平是升高的，兩組之間