MTX對(duì)映體誘導(dǎo)A549細(xì)胞耐藥后EGFR基因表達(dá)與侵襲轉(zhuǎn)移差異的研究.pdf

1、目的:建立耐氨甲蝶呤(MTX)對(duì)映體的A549細(xì)胞株模型,觀察MTX/A549耐藥細(xì)胞的生物學(xué)特征,侵襲轉(zhuǎn)移能力,探討表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)在MTX對(duì)映體L-(+)-MTX和D-(-)-MTX耐藥A549細(xì)胞株中的表達(dá)及對(duì)啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)分析,以期發(fā)現(xiàn)不同MTX對(duì)映體作用腫瘤細(xì)胞而引起腫瘤轉(zhuǎn)移能力差異的機(jī)制,為臨床合理使用MTX對(duì)映體藥物減少腫瘤轉(zhuǎn)移提供新的理論依據(jù)。
　　方法:采用濃度遞增結(jié)合低劑量持續(xù)誘導(dǎo),獲得耐受35μ

2、mol/L MTX對(duì)映體的細(xì)胞系,分別命名為L(zhǎng)-(+)-MTX/A549、D-(-)-MTX/A549;倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化;MTT法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線;MTT方法檢測(cè)L-(+)-MTX/A549和D-(-)-MTX/A549細(xì)胞的耐藥指數(shù);通過平板劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)L-(+)-MTX/A549和D-(-)-MTX/A549細(xì)胞遷移能力;采用雙層軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)L-(+)-MTX/A549、D-(-)-MTX/A549細(xì)胞的克

3、隆形成率和觀察集落的形態(tài);采用RT-PCR方法測(cè)定親本A549細(xì)胞、L-(+)-MTX/A549和D-(-)-MTX/A549兩種耐藥細(xì)胞株中EGFR基因表達(dá);采用MSP方法分析EGFR基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)。
　　結(jié)果:①采用濃度遞增結(jié)合低劑量持續(xù)誘導(dǎo)的方法,成功建立MTX不同對(duì)映體A549細(xì)胞的耐藥細(xì)胞株,L-(+)-MTX/A549、D-(-)-MTX/A549耐藥指數(shù)分別為6.12的和20.75。②倒置相差顯微鏡觀察耐藥細(xì)胞

4、株的形態(tài),親本A549細(xì)胞呈梭形生長(zhǎng),大小均一,分布均勻,排列緊密,貼壁牢固。D-(-)-MTX/A549細(xì)胞呈梭狀生長(zhǎng),與親本細(xì)胞形態(tài)接近,粘接明顯分散。L-(+)-MTX/A549細(xì)胞有部分細(xì)胞呈梭形生長(zhǎng),另外一部分細(xì)胞呈團(tuán)生長(zhǎng),粘附相近;③細(xì)胞生長(zhǎng)曲線顯示D-(-)-MTX/A549的增殖略慢于親本A549細(xì)胞,而L-(+)-MTX/A549的增值最慢;④72小時(shí)后D-(-)-MTX/A549細(xì)胞的遷移能力大于L-(+)-MTX/

5、A549細(xì)胞;⑤軟瓊脂實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)D-(-)-MTX/A549細(xì)胞、L-(+)-MTX/A549細(xì)胞和親本A549細(xì)胞的克隆形成率(％)分別為(1.38±0.17)、(1.36±0.13)和(1.37±0.15),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);⑥親本A549細(xì)胞、L-(+)-MTX/A549細(xì)胞均有EGFR mRNA表達(dá),其IDV值分別為(6630±64)、(3697±27),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。而的D-(-)-MTX/A

6、549細(xì)胞中EGFR基因不表達(dá);⑦M(jìn)SP的結(jié)果顯示,親本A549、D-(-)-MTX/A549和L-(+)-MTX/A549三種細(xì)胞中均發(fā)生甲基化。
　　結(jié)論:D-(-)-MTX/A549耐藥細(xì)胞在體外運(yùn)動(dòng)、增殖能力均大于L-(+)-MTX耐藥細(xì)胞,從而說明MTX對(duì)映體耐藥細(xì)胞后細(xì)胞的轉(zhuǎn)移力具有手性差異;MTX誘導(dǎo)耐藥后細(xì)胞株中EGFR mRNA發(fā)生變化,且在兩種對(duì)映體細(xì)胞株間具有明顯的手性差異,且MTX可能通過改變EGFR基因啟