Synaptotagmin Ⅰ和Ⅸ在分泌調(diào)節(jié)中的作用.pdf

1、Synaptotagmin（Syt）是一個(gè)廣泛存在于神經(jīng)和內(nèi)分泌細(xì)胞內(nèi)的分泌囊泡上的蛋白質(zhì)家族。作為鈣離子依賴性神經(jīng)遞質(zhì)和激素釋放過(guò)程中的鈣離子感受器, Synaptotagmin觸發(fā)和調(diào)節(jié)囊泡與靶膜的融合過(guò)程，參與對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)和激素釋放過(guò)程的嚴(yán)格調(diào)控, 也可能參與對(duì)細(xì)胞的蛋白質(zhì)與膜轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)。該家族在哺乳動(dòng)物中有16種亞型。它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)有各自不同的定位,并發(fā)揮不同的調(diào)節(jié)功能。通過(guò)亞型間以及亞型和效應(yīng)分子間的相互作用, 特別是對(duì)鈣離子的結(jié)

2、合，Synaptotagmin對(duì)胞吐過(guò)程進(jìn)行著有效地調(diào)控。在膜融合的事件中, 如果不是全部, 至少有很大一部分是需要鈣離子的存在的。Synaptotagmin就可能是一種在較為寬廣范圍的膜融合事件中廣泛分布的鈣離子敏感的融合機(jī)制中的調(diào)控蛋白。 本文通過(guò)對(duì)Synaptotagmin I（SytI）和IX（SytIX）亞型的研究，以期尋找較為合適的研究方法以便于在多亞型的蛋白家族功能的研究中進(jìn)行有效的功能定位。從而為Syt家族及相關(guān)

3、蛋白家族的功能研究提供高效篩選方法。 通過(guò)RNA干擾（RNAi）技術(shù)，在RNA的后轉(zhuǎn)錄階段將Syt基因的表達(dá)進(jìn)行沉默，將SytI和SytIX的表達(dá)量降至原表達(dá)量的10％－20％，形成Knockdown的效果，并在此基礎(chǔ)上對(duì)沉默的Syt基因進(jìn)行功能變化的檢測(cè)。并對(duì)siRNA和shRNA在沉默效果和在研究中的互補(bǔ)作用進(jìn)行比較。另外，在實(shí)驗(yàn)中還使用全新的量子點(diǎn)耦聯(lián)的抗Syt的IgG作為免疫熒光標(biāo)記探針，并在內(nèi)吞囊泡影像跟蹤中標(biāo)記Syt

4、蛋白。實(shí)驗(yàn)選用INS-1細(xì)胞和PC12細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，研究Syt在內(nèi)分泌和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中囊泡分泌事件中的不同功能。用膜電容檢測(cè)技術(shù)和碳纖電極安培檢測(cè)技術(shù)對(duì)細(xì)胞中囊泡分泌事件過(guò)程中的膜電容和電化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)，來(lái)標(biāo)定細(xì)胞功能的變化。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在一致的原則下設(shè)計(jì)的siRNA和shRNA有一致的沉默效率。且siRNA的sense鏈3’端的懸掛核苷酸的有無(wú)對(duì)siRNA的沉默效率沒(méi)有影響。通過(guò)選擇合適的目標(biāo)序列，shRNA的沉默

5、效率可達(dá)到約80％程度。免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，SytI在INS-1細(xì)胞和胰島素顆粒共存；在PC12細(xì)胞中和致密核心囊泡共存。 功能研究表明：與對(duì)照樣本相比較，由于INS-1細(xì)胞中Syt I 表達(dá)沉默導(dǎo)致的胞吐對(duì)鈣離子敏感性的降低，鈣依賴的胞吐中快成分被明顯降低，胞吐的速率常數(shù)也發(fā)生明顯變化，同時(shí)融合孔的擴(kuò)展受到抑制；在隨后的胞吞事件中，和對(duì)照樣本相比，快速胞吞成分明顯減小，胞吞的速率常數(shù)顯著地下降。在INS-1細(xì)胞中，Syt I

6、X的沉默對(duì)分泌過(guò)程沒(méi)有影響。PC12細(xì)胞中，分別對(duì)Syt I和SytIX沉默并沒(méi)用影響LDCV鈣依賴的胞吐過(guò)程，但同時(shí)對(duì)Syt I和SytIX進(jìn)行沉默時(shí)，胞吐明顯被抑制。推測(cè)在INS-1細(xì)胞內(nèi)SytIX對(duì)SytI沒(méi)有功能冗余作用，而在PC12細(xì)胞中，則存在相互間的功能冗余作用。也表明了在INS-1細(xì)胞和PC12細(xì)胞中，同一分子的不同功能定位。 用量子點(diǎn)耦聯(lián)的抗SytI的IgG對(duì)PC12細(xì)胞進(jìn)行孵育對(duì)內(nèi)吞囊泡進(jìn)行標(biāo)記，可見(jiàn)標(biāo)記的熒